检测原理和问题处理实用版课件

检测原理和问题处理检测原理和问题处理1优选检测原理和问题处理优选检测原理和问题处理2★实时荧光定量PCR检测技术

（Real-timePCR)

定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理★实时荧光定量PCR检测技术

（Real-timePCR)3什么是PCR？

什么是PCR？4PCR的反应过程PCR的反应过程5RT-PCR原理图RT-PCR原理图6荧光定量PCR的数学原理1、Baseline(基线)2、Threshold(阈值)3、ThresholdCycle(CT值)4、[DNA]0(初始模板)Threshold(阈值)[DNA]0(初始模板)ThresholdCycle(CT值)Baseline基线荧光定量PCR的数学原理Threshold[DNA]0Th7基线

反应荧光明显增加前的背景荧光值。默认为3-15cycles的信号值线性图谱对数图谱基线线性图谱对数图谱8阈值阈值=基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近。

阈值阈值=基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即PC9Ct值

扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即PCR增长信号与Threshold发生交汇的循环数，也是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。Ct值扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时10[DNA]0确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量[DNA]0确定初始模板的浓度11Real-timePCR动力学曲线和四个阶段

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。PCR理论方程只在指数期成立。Real-timePCR动力学曲线和四个阶段12PCR产物的量与扩增循环数间的

理论方程Rn=RB+X0(1+e)nRs

Rn:第N次PCR循环时的荧光信号强度RB:背景信号强度X0(1+e)nRs:每个分子的荧光强度与分子数目的乘积经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：得到：Ct=klgX0+b线性方程，lgX0

越大，则CT值越小！PCR产物的量与扩增循环数间的

理论方程Rn=RB+13

从荧光信号实现定量结果

一、检测荧光信号增长，获取样品CT值从荧光信号实现定量结果

一、检测荧光信号增14

从荧光信号实现定量结果

二、绘制标准曲线从荧光信号实现定量结果

二、绘制标准15

从荧光信号实现定量结果

三、以待测样品的Ct值对[DNA]0作图，得到定量结果从荧光信号实现定量结果

三、以待测样品的16SYBRGreenI工作原理图片演示探针设计有一定难度，需要验证效果原始数据-Component阈值=基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近。经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：实例5-2：直线扩增曲线扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即PCR增长信号与Threshold发生交汇的循环数，也是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。定量PCR的光学原理定量PCR的化学原理PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。定量PCR的光学原理定量PCR的数学原理灵敏、特异性高：每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，实时检测特异扩增片断，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性原因：基线设置的终点大于样品CT值。荧光PCR区别于其他PCR方法主要

有以下优点★实时荧光定量PCR检测技术

（Real-timePCR)同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理SYBRGreenI工作原理图片演示定量PCR的数学原17常用的荧光标记方法1、DNA双链特异性染料

SYBRGreen、SYTO9、LCGreen、Evagreen2、序列特异性探针TaqMan、MolecularBeacons（分子信标）、DualProbes(FRET)、LNA(LockedNucleicAcid)Double-Dyeprobes常用的荧光标记方法18SYBRGreenI

工作原理1、每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2、染料一结合，就产生荧光信号3、信号强度与DNA分子总数目成正比SYBRGreenI工作原理1、每形成一个DNA双链，19SYBRGreenI工作原理图片演示SYBRGreenI工作原理图片演示20熔解曲线(Dissociationcurve)目的：在PCR之后分析产物特异性基本程序：-解链；-复性；-升温检测；-降温；软件自动分析熔解曲线(Dissociationcurve)目的：在PC21融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。Tm值：50%DNA变成单链时所需要的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表产物序列的特异性；PCR反应完成后，控制体系温度缓慢升高，双链DNA解链成为单链DNA，SYBRGreen被释放，荧光信号逐渐减弱；当体系到达某一特定温度时，某些DNA双链会突然完全解离，荧光强度也显著减弱；对融解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，该处所对应的横坐标值（温度），即Tm融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产22融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。原始图谱导数图谱只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产23SYBRGreenI的优缺点成本低不需要制备序列特异的针对性探针，且试剂便宜适合初步筛查先用SYBR筛查，再对少数关键样品用探针法确认配合熔解曲线分析需鉴定PCR反应是否有杂带、引物二聚体特异性问题不能分辨主带与杂带，给出所有双链DNA的总信号多重定量问题每个PCR管只能检测一个目标基因SYBRGreenI的优缺点成本低24Taqman原理Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。Taqman原理Taqman荧光定量技术25TaqMan探针的作用机理TaqMan探针的作用机理26原因：基线设置的终点大于样品CT值。没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰解决方案：减小基线终点设置至最小CT值前4个循环，重新分析数据。原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。不同的探针识别不同的靶基因Rn=RB+X0(1+e)nRs需鉴定PCR反应是否有杂带、引物二聚体原始数据-ComponentRn=RB+X0(1+e)nRs反应体系“扩增效率”低下只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。1、每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去实例5-2：直线扩增曲线定量PCR的化学原理只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。不同的荧光报告基团标记不同的探针经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。Taqman探针优点灵敏、特异性高：每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，实时检测特异扩增片断，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性有多种不同波长的荧光基团对可供选择，可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响

缺点探针设计有一定难度，需要验证效果探针合成质量对试验结果有较大影响荧光标记成本较高原因：基线设置的终点大于样品CT值。Taqman探针优点27多重检测原理

同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因不同的荧光报告基团标记不同的探针目的

提高效率，节省时间降低研究成本特点

一次提取DNA/RNA、一次反应、定量多个基因要保证信号之间互不干扰多重检测原理28常用的荧光染料常用的荧光染料29DyeExcitationMaxima(nm)EmissionMaxima(nm)FAM495520SGI497522TET521540VIC530552JOE526552HEX540557CY3552570TAMRA552578ROX585605TexasRed595615CY5643667DyeExcitationMaxima(nm)Emiss30定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理定量PCR的数学原理31检测原理和问题处理实用版课件32检测原理和问题处理实用版课件33荧光PCR区别于其他PCR方法主要

有以下优点

1)全封闭反应，无需PCR后处理

2)特异性强，灵敏度高

3)采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确

4)定量范围宽，可达到10个数量级

5)仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断

6)可实现一管双检或多检

7)操作安全，缩短时间，提高效率

8)利于自动化和联网管理荧光PCR区别于其他PCR方法主要

有以下优点

1)全封闭34

定量PCR常见问题处理

35扩增曲线-AmplificationPlot

扩增曲线-AmplificationPlot36扩增与荧光信号的增加不一致。1)全封闭反应，无需PCR后处理

2)特异性强，灵敏度高

3)采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确

4)定量范围宽，可达到10个数量级

5)仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断

6)可实现一管双检或多检

7)操作安全，缩短时间，提高效率

8)利于自动化和联网管理PCR反应完成后，控制体系温度缓慢升高，双链DNA解链成为单链DNA，SYBRGreen被释放，荧光信号逐渐减弱；4、[DNA]0(初始模板)原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。在使用SYBRGreen染料的实验中，没有引入“融解曲线分析”融解曲线(Dissociationcurve)原始数据-ComponentRn=RB+X0(1+e)nRs从荧光信号实现定量结果

一、检测荧光信号增长，获取样品CT值FAM/ROX的校正后，基线不是水平的直线；融解曲线(Dissociationcurve)原始数据-Component•扩增曲线是一根水平直线通常是因为模板DNA浓度过高，若CT值<15，而基线范围仍然取3-15其中基线荧光包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值设定过高。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。在使用SYBRGreen染料的实验中，没有引入“融解曲线分析”要保证信号之间互不干扰定量PCR的化学原理2、Threshold(阈值)标准曲线-StandardCurve

扩增与荧光信号的增加不一致。标准曲线-StandardCu37原始数据-Component

原始数据-Component38各波长的原始信号-Spectra

各波长的原始信号-Spectra39融解曲线-Dissociation

融解曲线-Dissociation40定量PCR实验中的10个常见缺陷1.引物或探针的设计不过关2.RNA模板质量差3.没有使用“预混液”，导致差异的累积4.发生污染5.没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰6.选取了不恰当的“内参基因”7.在使用SYBRGreen染料的实验中，没有引入“融解曲线分析”8.没有正确设置“基线”和“阈值线”9.反应体系“扩增效率”低下10.标准曲线的范围没有涵盖样品量的变化定量PCR实验中的10个常见缺陷1.引物或探针的设计不过关41导致异常实验数据的常见原因错误的荧光染料设置错误的反应程序设置荧光污染反应试剂质量问题仪器硬件问题未正确密封而导致的试剂蒸发导致异常实验数据的常见原因错误的荧光染料设置42实例1：没有标准曲线标准品没有填写相应的数值实例1：没有标准曲线标准品没有填写相应的数值43实例2：没有扩增曲线原因1：PCR参数设置错误−数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。实例2：没有扩增曲线原因1：PCR参数设置错误44实例2：没有扩增曲线原因2：硬盘休眠，数据采集中断实例2：没有扩增曲线原因2：硬盘休眠，数据采集中断45实例3：基线下滑从原始数据找原因−1-9循环，ROX的信号下降−基线设定4-13范围内，ROX信号值变化，FAM的信号值基本固定；FAM/ROX的校正后，基线不是水平的直线；−应该取ROX信号稳定的10-20循环为合理的基线范围。实例3：基线下滑从原始数据找原因46•扩增曲线是一根水平直线各波长的原始信号-Spectra探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰解决方案：减小基线终点设置至最小CT值前4个循环，重新分析数据。扩增与荧光信号的增加不一致。不同的探针识别不同的靶基因优选检测原理和问题处理经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：实例5-2：直线扩增曲线扩增曲线-AmplificationPlot探针合成质量对试验结果有较大影响没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰荧光PCR区别于其他PCR方法主要

有以下优点PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即PCR增长信号与Threshold发生交汇的循环数，也是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。−数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。1、每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去原始数据-Component3、信号强度与DNA分子总数目成正比实例3：基线下滑修改基线范围为10-20，重新分析•扩增曲线是一根水平直线实例3：基线下滑修改基线范围为10-47实例3：基线下滑基线范围取10-20循环的数据，重新分析后的图谱实例3：基线下滑基线范围取10-20循环的数据，重新分析后的48实例4：扩增曲线弯曲

原因：基线设置的终点大于样品CT值。通常是因为模板DNA浓度过高，若CT值<15，而基线范围仍然取3-15其中基线荧光包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值设定过高。解决方案：减小基线终点设置至最小CT值前4个循环，重新分析数据。实例4：扩增曲线弯曲原因：基线设置的终点大于样品CT值。49实例4：扩增曲线弯曲原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。解决方案：对于能检测出Ct的样品，读出数据；浓度太高的样品，需稀释后另做实验。实例4：扩增曲线弯曲原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高50实例5-1：直线扩增曲线部分探针降解后，部分报告荧光基团从探针上脱落导致：基线抬高；扩增与荧光信号的增加不一致。实例5-1：直线扩增曲线部分探针降解后，部分报告荧光基团从探51熔解曲线(Dissociationcurve)−基线设定4-13范围内，ROX信号值变化，FAM的信号值基本固定；融解曲线(Dissociationcurve)3、信号强度与DNA分子总数目成正比解决方案：对于能检测出Ct的样品，读出数据；原始数据-ComponentRn=RB+X0(1+e)nRs经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因Rn=RB+X0(1+e)nRs只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。原始数据-ComponentTaqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。4、[DNA]0(初始模板)扩增与荧光信号的增加不一致。从荧光信号实现定量结果

一、检测荧光信号增长，获取样品CT值融解曲线(Dissociationcurve)定量PCR的光学原理从荧光信号实现定量结果

二、绘制标准曲线要保证信号之间互不干扰Rn=RB+X0(1+e)nRs融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。未正确密封而导致的试剂蒸发Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量Rn=RB+X0(1+e)nRs优选检测原理和问题处理•扩增曲线是一根水平直线扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即PCR增长信号与Threshold发生交汇的循环数，也是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。导致异常实验数据的常见原因定量PCR的光学原理标准曲线的范围没有涵盖样品量的变化要保证信号之间互不干扰Rn=RB+X0(1+e)nRs探针合成质量对试验结果有较大影响SYBRGreenI工作原理图片演示反应体系“扩增效率”低下从荧光信号实现定量结果

一、检测荧光信号增长，获取样品CT值★实时荧光定量PCR检测技术

（Real-timePCR)避免了荧光染料对PCR反应的影响实例5-2：直线扩增曲线•扩增曲线是一根水平直线•说明没有检测到信号，提示实验失败熔解曲线(Dissociationcurve)Rn=R52检测原理和问题处理检测原理和问题处理53优选检测原理和问题处理优选检测原理和问题处理54★实时荧光定量PCR检测技术

（Real-timePCR)

定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理★实时荧光定量PCR检测技术

（Real-timePCR)55什么是PCR？

什么是PCR？56PCR的反应过程PCR的反应过程57RT-PCR原理图RT-PCR原理图58荧光定量PCR的数学原理1、Baseline(基线)2、Threshold(阈值)3、ThresholdCycle(CT值)4、[DNA]0(初始模板)Threshold(阈值)[DNA]0(初始模板)ThresholdCycle(CT值)Baseline基线荧光定量PCR的数学原理Threshold[DNA]0Th59基线

反应荧光明显增加前的背景荧光值。默认为3-15cycles的信号值线性图谱对数图谱基线线性图谱对数图谱60阈值阈值=基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近。

阈值阈值=基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即PC61Ct值

扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即PCR增长信号与Threshold发生交汇的循环数，也是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。Ct值扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时62[DNA]0确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量[DNA]0确定初始模板的浓度63Real-timePCR动力学曲线和四个阶段

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。PCR理论方程只在指数期成立。Real-timePCR动力学曲线和四个阶段64PCR产物的量与扩增循环数间的

理论方程Rn=RB+X0(1+e)nRs

Rn:第N次PCR循环时的荧光信号强度RB:背景信号强度X0(1+e)nRs:每个分子的荧光强度与分子数目的乘积经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：得到：Ct=klgX0+b线性方程，lgX0

越大，则CT值越小！PCR产物的量与扩增循环数间的

理论方程Rn=RB+65

从荧光信号实现定量结果

一、检测荧光信号增长，获取样品CT值从荧光信号实现定量结果

一、检测荧光信号增66

从荧光信号实现定量结果

二、绘制标准曲线从荧光信号实现定量结果

二、绘制标准67

从荧光信号实现定量结果

三、以待测样品的Ct值对[DNA]0作图，得到定量结果从荧光信号实现定量结果

三、以待测样品的68SYBRGreenI工作原理图片演示探针设计有一定难度，需要验证效果原始数据-Component阈值=基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近。经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：实例5-2：直线扩增曲线扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即PCR增长信号与Threshold发生交汇的循环数，也是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。定量PCR的光学原理定量PCR的化学原理PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。定量PCR的光学原理定量PCR的数学原理灵敏、特异性高：每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，实时检测特异扩增片断，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性原因：基线设置的终点大于样品CT值。荧光PCR区别于其他PCR方法主要

有以下优点★实时荧光定量PCR检测技术

（Real-timePCR)同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理SYBRGreenI工作原理图片演示定量PCR的数学原69常用的荧光标记方法1、DNA双链特异性染料

SYBRGreen、SYTO9、LCGreen、Evagreen2、序列特异性探针TaqMan、MolecularBeacons（分子信标）、DualProbes(FRET)、LNA(LockedNucleicAcid)Double-Dyeprobes常用的荧光标记方法70SYBRGreenI

工作原理1、每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2、染料一结合，就产生荧光信号3、信号强度与DNA分子总数目成正比SYBRGreenI工作原理1、每形成一个DNA双链，71SYBRGreenI工作原理图片演示SYBRGreenI工作原理图片演示72熔解曲线(Dissociationcurve)目的：在PCR之后分析产物特异性基本程序：-解链；-复性；-升温检测；-降温；软件自动分析熔解曲线(Dissociationcurve)目的：在PC73融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。Tm值：50%DNA变成单链时所需要的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表产物序列的特异性；PCR反应完成后，控制体系温度缓慢升高，双链DNA解链成为单链DNA，SYBRGreen被释放，荧光信号逐渐减弱；当体系到达某一特定温度时，某些DNA双链会突然完全解离，荧光强度也显著减弱；对融解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，该处所对应的横坐标值（温度），即Tm融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产74融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。原始图谱导数图谱只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产75SYBRGreenI的优缺点成本低不需要制备序列特异的针对性探针，且试剂便宜适合初步筛查先用SYBR筛查，再对少数关键样品用探针法确认配合熔解曲线分析需鉴定PCR反应是否有杂带、引物二聚体特异性问题不能分辨主带与杂带，给出所有双链DNA的总信号多重定量问题每个PCR管只能检测一个目标基因SYBRGreenI的优缺点成本低76Taqman原理Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。Taqman原理Taqman荧光定量技术77TaqMan探针的作用机理TaqMan探针的作用机理78原因：基线设置的终点大于样品CT值。没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰解决方案：减小基线终点设置至最小CT值前4个循环，重新分析数据。原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。不同的探针识别不同的靶基因Rn=RB+X0(1+e)nRs需鉴定PCR反应是否有杂带、引物二聚体原始数据-ComponentRn=RB+X0(1+e)nRs反应体系“扩增效率”低下只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。1、每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去实例5-2：直线扩增曲线定量PCR的化学原理只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。不同的荧光报告基团标记不同的探针经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。Taqman探针优点灵敏、特异性高：每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，实时检测特异扩增片断，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性有多种不同波长的荧光基团对可供选择，可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响

缺点探针设计有一定难度，需要验证效果探针合成质量对试验结果有较大影响荧光标记成本较高原因：基线设置的终点大于样品CT值。Taqman探针优点79多重检测原理

同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因不同的荧光报告基团标记不同的探针目的

提高效率，节省时间降低研究成本特点

一次提取DNA/RNA、一次反应、定量多个基因要保证信号之间互不干扰多重检测原理80常用的荧光染料常用的荧光染料81DyeExcitationMaxima(nm)EmissionMaxima(nm)FAM495520SGI497522TET521540VIC530552JOE526552HEX540557CY3552570TAMRA552578ROX585605TexasRed595615CY5643667DyeExcitationMaxima(nm)Emiss82定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理定量PCR的数学原理83检测原理和问题处理实用版课件84检测原理和问题处理实用版课件85荧光PCR区别于其他PCR方法主要

有以下优点

1)全封闭反应，无需PCR后处理

2)特异性强，灵敏度高

3)采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确

4)定量范围宽，可达到10个数量级

5)仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断

6)可实现一管双检或多检

7)操作安全，缩短时间，提高效率

8)利于自动化和联网管理荧光PCR区别于其他PCR方法主要

有以下优点

1)全封闭86

定量PCR常见问题处理

87扩增曲线-AmplificationPlot

扩增曲线-AmplificationPlot88扩增与荧光信号的增加不一致。1)全封闭反应，无需PCR后处理

2)特异性强，灵敏度高

3)采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确

4)定量范围宽，可达到10个数量级

5)仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断

6)可实现一管双检或多检

7)操作安全，缩短时间，提高效率

8)利于自动化和联网管理PCR反应完成后，控制体系温度缓慢升高，双链DNA解链成为单链DNA，SYBRGreen被释放，荧光信号逐渐减弱；4、[DNA]0(初始模板)原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。在使用SYBRGreen染料的实验中，没有引入“融解曲线分析”融解曲线(Dissociationcurve)原始数据-ComponentRn=RB+X0(1+e)nRs从荧光信号实现定量结果

一、检测荧光信号增长，获取样品CT值FAM/ROX的校正后，基线不是水平的直线；融解曲线(Dissociationcurve)原始数据-Component•扩增曲线是一根水平直线通常是因为模板DNA浓度过高，若CT值<15，而基线范围仍然取3-15其中基线荧光包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值设定过高。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。在使用SYBRGreen染料的实验中，没有引入“融解曲线分析”要保证信号之间互不干扰定量PCR的化学原理2、Threshold(阈值)标准曲线-StandardCurve

扩增与荧光信号的增加不一致。标准曲线-StandardCu89原始数据-Component

原始数据-Component90各波长的原始信号-Spectra

各波长的原始信号-Spectra91融解曲线-Dissociation

融解曲线-Dissociation92定量PCR实验中的10个常见缺陷1.引物或探针的设计不过关2.RNA模板质量差3.没有使用“预混液”，导致差异的累积4.发生污染5.没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰6.选取了不恰当的“内参基因”7.在使用SYBRGreen染料的实验中，没有引入“融解曲线分析”8.没有正确设置“基线”和“阈值线”9.反应体系“扩增效率”低下10.标准曲线的范围没有涵盖样品量的变化定量PCR实验中的10个常见缺陷1.引物或探针的设计不过关93导致异常实验数据的常见原因错误的荧光染料设置错误的反应程序设置荧光污染反应试剂质量问题仪器硬件问题未正确密封而导致的试剂蒸发导致异常实验数据的常见原因错误的荧光染料设置94实例1：没有标准曲线标准品没有填写相应的数值实例1：没有标准曲线标准品没有填写相应的数值95实例2：没有扩增曲线原因1：PCR参数设置错误−数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。实例2：没有扩增曲线原因1：PCR参数设置错误96实例2：没有扩增曲线原因2：硬盘休眠，数据采集中断实例2：没有扩增曲线原因2：硬盘休眠，数据采集中断97实例3：基线下滑从原始数据找原因−1-9循环，ROX的信号下降−基线设定4-13范围内，ROX信号值变化，FAM的信号值基本固定；FAM/ROX的校正后，基线不是水平的直线；−应该取ROX信号稳定的10-20循环为合理的基线范围。实例3：基线下滑从原始数据找原因98•扩增曲线是一根水平直线各波长的原始信号-Spectra探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰解决方案：减小基线终点设置至最小CT值前4个循环，重新分析数据。扩增与荧光信号的增加不一致。不同的探针识别不同的靶基因优选检测原理和问题处理经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：实例5-2：直线扩增曲线扩增曲线-AmplificationPlot探针合成质量对试验结果有较大影响没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰荧光PCR区别于其他PCR方法主要

有以下优点PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即PCR增长信号与Threshol