共振光散射技术在药物分析中的应用

共振光散射技术在药物分析中的应用【内容摘要】对共振光散射技术在药物与生物大分子分析测定中的应用状态及其进展进行了综述。重点介绍了该方法在生物体液中药物的分析和中药成分的分析应用前景。为体内大分子药物及其他药物成分的检测方法研究提供了新途径。【本文关键词语】共振光散射技术;药物分析abstract:theapplicationandthedevelopmentoftheresonancelightscattering(rls)methodusedindrugdeterminationandthebiomacromoleculedeterminationwasreviewed.theapplicationofrlsinpharmaceuticalquantificationinbiologicalfluids,andtheapplicationofrlsinquantificationofchinesemedicinewerereviewed.thismethodmightbeanovelwayforthedeterminationmacromoleculardrugsandothermedicinalingredientsinvivo.keywords:resonancelightscattering;pharmaceuticalquantification共振光散射(resonancelightscattering，rls)是利用普通荧光分光光度法对散射光进行测量的一种散射光分析技术[1]。该技术由于其简单、快速、灵敏的分析特点，吸引了生命科学、分析化学、环境科学、材料科学等领域的分析工作者对其理论和应用进行了深切进入的研究，促进了分析学科内部各个分支之间的联络，尤其是在生化领域已经获得一定的研究结果[2]。光散射现象广泛存在于光与粒子互相作用的经过中，当介质中粒子的直径(d)与入射光波长(λ0)存在d≤0.05λ0时，产生的是以瑞利(rayleigh)散射为主的分子散射光[3]。根据rls理论能够得到散射光强度与散射粒子的浓度c成正比的关系，即irls=kcb。据此能够用于大分子物质溶液的分析测定[1]。rls分析法灵敏度高，操作简单方便，可通过普通荧光分光光度计同步扫描得到完好的rls特征光谱和相应rls峰。由于rls法源于rayleigh散射光吸收光谱，它对分子构造大小和形状(如球形、链形、无规则线团等)、电荷分布、键合性质等研究还能提供新的、更丰富的信息。近年来的研究证明，rls法还可用于痕量金属、外表活性剂以及纳米材料[4,5]等方面的研究测定。该方法一般不需要对样品进行复杂的化学预处理，避免了一系列烦琐的操作程序，而直接将处理好的样品溶液置于普通的荧光分光光度计中进行测定即可。1体液中生物大分子的测定1.1蛋白质蛋白质的功能许多，与生命的起源和生物的进化、细胞构造、病毒、免疫、酶、激素、物质的遗传等有亲密的联络，它是生命现象的物质基础。蛋白质定量测定是生物化学和生命学科中经常牵涉的分析内容，在临床医学中也有主要应用。当前，蛋白质测定方法重要有lowry法[6]，bradford法[7]，biuret法[8]，bromoeersolgreen法[9]与bormophenolblue法[10]等。pasetmack[1]将rls技术用于测定微量蛋白质以来，rls法分析技术以其方法简单、快速、灵敏度高，在生物大分子分析测定研究中的报道日益增加，灵敏度可达纳克级[11]。黄承志等研究了阴离子外表活性剂罗丹明b(rhodamineb，rhb)与十二烷基硫酸钠(sds)蛋白质体系的rls光谱特征。实验发现，sds与hsa(humanserumalbumin，hsa)结合后再与rhb作用，其散射光强度加强。且rls加强的水平与蛋白的浓度在一定范围内呈线性关系。据此，建立了一种测定人血清中总蛋白质的新方法[12]。胡之德等基于在ph2.11的酸性溶液中，聚乙二醇辛基苯基醚(op)对亮丽春红5r蛋白质体系的rls信号有强烈的增敏现象，建立了op蛋白质亮丽春红5r三元体系测定人血清中蛋白质浓度的新方法。该体系对人血清白蛋白检测的线性范围在0.0～10.0pg·ml-1之间，检测限为5.0ng·ml-1，检测实际样品的回收率在97.80%～109.62%之间，方法令人满意[13]。王锡宁等利用rls技术测定白蛋白、红蛋白。研究了间苯二酚黄op蛋白质体系rls光谱特性，确定了在340.0nm处，ph2.40，间苯二酚黄浓度为2.3×10-5mol·l-1，op的浓度为3.0×10-5mol·l-1时为最佳反应条件，据此建立了一种灵敏度高的测定蛋白质的新方法[14]。薛蓓等研究了流动打针(fia)rls技术联用在线测定人血清中蛋白质含量。以sds为荧光探针，利用未曾报道过的rls与fia联用检测人血清样品中蛋白质含量。与单纯用rls法测定比较，分析时间由40min缩短至1min，rls信号的重现性得到了显著改善，提升了实验的灵敏度和重现性[15]。梁宏等在普通荧光分光光度计上选择适宜的激发光和发射光通带宽度，利用rls技术，研究了生理ph值(7.43±0.02)，25℃下，金(ⅲ)与血清白蛋白的互相作用。初次观测到金(ⅲ)对血清白蛋白的rls强度随着金(ⅲ)浓度增长而降低。结果表示清楚，金(ⅲ)与血清白蛋白的结合会毁坏血清白蛋白分子聚集，使血清白蛋白中的二硫桥键断裂，导致白蛋白分子趋于松懈，散射截面积减小，表现为rls强度降低[16]。1.2核酸核酸是遗传信息的载体和基因表达的物质基础，在生物的生长、发育等活动中具有特别主要的作用。当前核酸分析测定的方法重要有分光光度法、荧光光度法、化学发光法、探针技术法、免疫分析法等，其中分光光度法[17]和荧光光度法[18]使用较多。紫外分光光度法操作简单，但由于灵敏度低，测定的干扰因素多，使其在应用上遭到了限制;荧光分析法具有选择性好和灵敏度高，但荧光试剂价格昂贵，而且部分荧光试剂有致癌活性。针对上述情况，rls法因操作简便快速，灵敏度高，试剂无毒性等优势，在核酸分析中也得到了广泛的应用。黄承志等利用溴化十六烷基三甲铵(cetyltrimethylammonsiumbromide,ctmab)是阳离子外表活性剂，核酸因带有大量的磷酸根而带负电荷的特性，证明了ctmab和核酸通过静电引力共吸附到液/液界面上构成两性复合物，导致强烈增长的全内反射共振光散射(totalinternalreflectedresonancelightscattering，tirrls)信号，tirrls信号强度与核酸的浓度呈线性[19]。刘绍璞等研究了5种阳离子外表活性剂与核酸反应的rls光谱[20]。陈展光等初次利用诺氟沙星做为rls光谱探针，测定了叶绿体脱氧核糖核酸(ctdna)。在ph5.87的br(brittonrobinson)缓冲溶液中，波长405.5nm处出现最大rls峰，ctdna的线性响应范围为0.02～2.30μg·ml-1，检测限为1.2ng·ml-1。还合成了希夫碱试剂三(2(邻羟基苯基亚甲氨基)乙基)胺，而且研究了其与核酸在盐酸介质中的反应。对希夫碱剂三(2(邻羟基苯基亚甲氨基)乙基)胺dna体系的研究发现，在393.0nm处增长的rls强度与核酸的浓度成线性关系(ctdna，0.01～4.50μg·ml-1;fsdna，0.01～5.00μg·ml-1)。ctdna的检测限是1.4ng·ml-1，fsdna的检测限是2.1ng·ml-1。结果与紫外可见分光光度法测得结果一致[21]。林枫等研究在ph4.0介质中参加dna和阳离子外表活性剂可使二甲酚橙的rls加强，据此建立了以二甲酚橙为分子探针测定dna的分析方法，适用于合成样品中的dna测定[22]。2在化学药分析中的应用黄承志等利用具有双亲性的rhbctmab全内反射共振光散射法测定肝素，肝素通过与rhb和ctmab互相作用构成三元双亲性的复合物rhb肝素ctmab，而被rhb和ctmab协同吸附在水/四氯化碳(h2o/ccl4)界面上，引起强烈的tirrls加强信号用于肝素的测定[19]。陈展光等在氧氟沙星茜素紫3b体系中发现，ph5.09的br缓冲溶液中，在439.5nm处，0.10～2.50μg·ml-1范围内的氧氟沙星与增长的rls强度成线性关系。与此同时，在ph6.90，405.0nm处，0.05～3.00μg·ml-1范围内的氧氟沙星与rls强度成线性关系，检测限分别为0.013μg·ml-1，0.021μg·ml-1[21]。氧氟沙星茜素紫3b体系可用于人体的氧氟沙星血药浓度测定。还建立了人血清中抗菌类四季铵化合物的rls技术检测方法[23]。陈展光等，建立的二溴羟基苯基荧光酮(dbhpf)曲通(triton)x100钼的共振光散射光谱新体系，分析测定了中药、头发以及水中的微量钼[21]。刘云富等研究发如今硫酸介质中，砷钼杂多酸与碱性染料rhb缔合导致rhb体系的rls强度减弱，在一定浓度范围内，砷(ⅴ)的含量与体系减弱的rls强度成线性关系，据此建立了rls技术测定砷(ⅴ)的新方法[24]。3在中药分析中的应用黄承志等，研究了荧光素(flu)小檗碱(be)全内反射共振光散射法测定小檗碱。采取tirrls技术通过flu与be在水/1,2,二氯乙烷(h2o/dce)界面反应研究了be在界面上的特性。flu与be构成双亲性的复合物，在h2o/dce界面富集，并引起强烈增长的tirrls信号，最大吸收波长位于373.0nm，所得信号强度在一定范围内与be浓度成正比关系，检测限为1.3ng·ml-1。本方法与药典使用的hplc方法对照灵敏度有所提升[19]。张忆华等，在ph为10.0的tris缓冲溶液中建立了绿原酸ctmabctdna体系，实验表示清楚，440.0nm处加强的rls光强度(δirls)稳定，在0.002～0.10μg·ml-1的浓度范围内，体系δirls与ctdna的浓度具有良好的线性关系，检测限为0.6ng·ml-1。在厚朴酚ctmabctdna体系中，选择ph值为10.0的tris缓冲溶液来控制反应体系的酸度，356.0nm作为定量分析的波长。在0.02～1.00μg·ml-1的浓度范围内，δirls与ctdna的浓度具有良好的线性关系。在最佳反应条件，320.0nm处，ph10.0时，儿茶素ctmabctdna体系在0.02～1.00μg·ml-1的浓度范围内，δirls与ctdna的浓度成线性关系。类似的实验还有山柰酚ctmabctdna体系。除此之外，张忆华还研究了三价稀土离子与槲皮素、山柰酚所构成的络合物的rls光谱，研究了ctdna对它的淬灭作用。建立了tb3+/eu3+槲皮素ctdna体系以及tb3+/eu3+山柰酚ctdna体系，结果表示清楚，槲皮素与山柰酚通过配位作用与tb3+/eu3+结合，引起体系rls光强度的增长，而当参加ctdna后，体系的rls光强度降低，原因是ctdna构造中的磷酸骨架能够与tb3+和eu3+发生螯合作用，导致溶液中ctdna和山柰酚与tb3+/eu3+的竞争配位。该方法获得了明显的实验结果[25]。4结束语由于rls技术是建立在普通光谱法基础上，分析结果固然是物质的散射光谱信息，但物质形态特征等却不能被获取。基于此问题，一种结合显微成像技术的共振光散射成像技术被建立起来，对生物大分子的聚集形态进行了深切进入的研究和讨论[26]，仪器的性能和工作条件对所获信号影响大。由于rls光谱在较大光谱通带下获得，因此晦气于光谱精细构造的研究。固然我们知道散射光强度与散射粒子浓度有关，但出发点是从同步光谱开始的，显然其测定公式推导并未牵涉rls的散射实质。因而，用于分析化学的rls技术原理与定量基础尚未有定论。固然rls技术作为一种新兴的分析测定技术存在一些不足，但随着rls技术理论和应用上研