K562细胞过表达MHCⅠ类相关抗原A对树突状细胞吞噬功能的影响

K562细胞过表达MHCI类相关抗原A对树突状细胞吞噬功

能的影响张跃;邵小青;陈贝;季明春;龚卫娟【摘要】ObjectiveToobservehowapoptosedK562cellswithoverexpressionofMHCclassIchain-relatedproteinA(MICA)affectsphagocyticfunctionofdendriticcells.MethodsAtfirstaK562celllinewithectopicMICAexpression,calledK562-MICA,wasgeneratedbygenetransfectionandG418screen.BothK562andK562-MICAcellswerestainedwithfluorescentCFSE,treatedwithmitomycinC,andthenco-culturedwithTHP1cellsordendriticcellsderivedfromperipheralbloodmonocytesovernight.Phagocyticactivitieswereevaluatedthroughdetectionofpercentageofap-optoticcellsbyflowcytometry.Meanwhile,someactivatingreceptorsonTHP1cellsandNKG2DexpressiononDCweremeasuredbyflowcytometry.FinallyNKG2Dneutralizingantibodywasaddedtocellco-culturesystemtoobservewhetherphagocytosisofDCwouldbevariedcorrespondingly.ResultsK562-MICAcellsstimulatedTHP1celltoenhanceexpressionofCD86andMICA,buthadnoeffectsonHLA-DRandNKG2Dexpression.ComparedwithK562cells,apoptoticbodiesfromK562-MICAcellsweremoresusceptibletobeuptakebyDC.ApoptosedK562-MICAcellsinducedDCtoincreaseNKG2Dexpression.Inaddition,NKG2DantibodycouldsignificantlyinhibitphagocytosisofDC.ConclusionMICAover-expressiononK562cellspromotedphagocyticfunctionofDC,andthefunctiondependedonNKG2DexpressiononDC.%

目的观察过表达MHCI类相关抗原A(MICA)的K562细胞，体外经诱导凋亡后，对树突状细胞(DC)吞噬功能的影响.方法首先利用脂质体介导的基因转染技术和G418筛选过程,建立稳定表达MICA的K562细胞(K562-MICA).其次分别取K562、K562-MICA细胞经CFSE标记,并用丝裂霉素C诱导凋亡，与单核细胞系THP1或外周血单核细胞来源的DC共孵育过夜流式细胞术检测2种细胞吞噬凋亡小体的活性.同时检测THPI细胞表面相关活化性受体的表达以及DC表面NKG2D受体的情况.最后，在细胞共培养体系中加入NKG2D抗体，观察DC吞噬活性的变化.结果K562-MICA细胞可刺激THP1细胞上调CD86和MICA的表达，但对HLA-DR及NKG2D的表达无明显影响.与K562细胞相比，来自K562-MICA的凋亡小体更容易被DC吞噬.K562-MICA凋亡小体可诱导DC上调NKG2D表达,NKG2D抗体具有显著拮抗DC吞噬功能的活性.结论MICA过表达于K562细胞后具有促进DC吞噬功能的活性，这种活性依赖于DC表面NKG2D的表达.【期刊名称】《实用临床医药杂志》【年(卷)，期】2012(016)022【总页数】4页(P14-17)【关键词】MICA;树突状细胞;肿瘤;吞噬【作者】张跃;邵小青;陈贝;季明春;龚卫娟【作者单位】扬州大学医学院病原生物学和免疫学教研室，江苏扬州,225001;扬州大学医学院病原生物学和免疫学教研室，江苏扬州,225001;扬州大学医学院病原生物学和免疫学教研室，江苏扬州,225001;扬州大学医学院病原生物学和免疫学教研室，江苏扬州,225001;扬州大学医学院病原生物学和免疫学教研室,江苏扬州,225001【正文语种】中文【中图分类】R392.2MHCI类相关抗原A(MICA)是细胞受到应激反应后在其表面表达的一种蛋白。MICA受体为表达于NK、NKT、CD8+T、yST等细胞表面的活化性受体NKG2D。当NKG2D与其配体结合后，主要通过与其偶联的转接蛋白DAP10传递活化信号，是介导细胞毒功能的关键蛋白［1］。近来研究［2-3］发现,MICA具有介导NK细胞与DC之间相互作用的活性,MICA阳性表达的肿瘤细胞易被NK细胞攻击而进入凋亡状态。因此，本文试图观察肿瘤细胞过表达MICA抗原时，被诱导形成的凋亡小体对DC吞噬活性的影响。该研究将深入揭示使用某些化学药物诱导肿瘤细胞凋亡或上调MICA抗原表达时，不仅直接影响天然免疫功能,且因具有调节DC的活性继而对获得性免疫功能产生影响［4-5］。【期刊名称】《实用临床医药杂志》1材料与方法1.1材料与试剂重组pcDNA3.1-MICA表达载体由本室自行构建并保存［4］,红白血病细胞株K562,单核细胞株THP1均来自美国ATCC,由本室常规保存。夕卜周血淋巴细胞分离液购自挪威Axis-shield公司。RPMI1640培养基购自Invitrogen公司。胎牛血清购自杭州四季青公司,G418、青霉素、链霉素、两性霉素日购自上海生工生物公司。丝裂霉素C来自Sigma公司。脂质体转染试剂盒lipofectamine2000购自Invitrogen公司。重组人GM-CSF、IL-4购自PeproTech公司。FITC-抗-CD14mAb,APC-抗-CD11cmAb,PE-抗-MICAmAb,PE-抗-HLA-DRmAb,PE-Cy5-抗-CD86mAb,PE-抗-NKG2DmAb,NKG2D中和性抗体均购自Biolegend或eBioscience公司。CFSE细胞染色试剂盒来自Invitrogen公司。流式细胞仪FACSArial来自BectonDickinson公司。1.2稳定表达MICA抗原的K562细胞株的建立无菌条件下抽提质粒，按照Invitrogen公司的说明书进行操作，具体过程为:取对数期的K562细胞置于24孔内，共10孔。取16pg的质粒用质粒稀释液稀释至总量400pL,取32pL的脂质体用无血清培养基稀释至总量400pL,2者混合，室温孵育10min,每孔加入100pL的复合物，另夕卜两孔作为阴性对照。37。^5%。02培养4h后加入全培养基,48h后加入G418筛选。2周后筛选出G418抗性的细胞。对筛选出的细胞用PE-MICA抗体标记,进一步用流式细胞术分选,得到纯度＞90%的K562-MICA细胞。1.3流式细胞术检测THP1细胞的表型分别取对数期培养的K562和K562-MICA细胞，用丝裂霉素C(30pg/mL)37。处理3h,全培养基洗涤3遍。按1:1比例与THP1细胞孵育过夜。收集混合培养的细胞，分别标记CD14和CD86、MICA、HLA-DR和NKG2D的抗体，流式细胞仪分析CD14阳性细胞内各细胞表面分子的表达。DC的体外诱导常规分离夕卜周血单个核细胞(PMBCs),计数并调整细胞的密度为2x106/mL。将细胞铺于24孔板中培养(每孔500pL,约1x106个细胞/孔),37。,50mL/LC02条件下培养过夜。次日去掉未贴壁的细胞，加新鲜培养基,并加细胞因子GM-CSF(100ng/mL)和IL-4(40ng/mL)继续C02培养。隔日半量换液，培养5d,诱导为未成熟DC。DC对肿瘤细胞凋亡小体的吞噬分别取对数期培养的K562、K562-MICA细胞株，悬浮于1pL5mmol/L的CFSE,37。孵育10min,5倍体积全培养基洗涤终止反应。CFSE标记的细胞用丝裂霉素C(10、30pg/mL)处理37。孵育3h后，经全培养基洗涤后与未成熟DC按3:1比例孵育过夜。次日混合细胞悬液用CD11c抗体或HLA-DR抗体标记，流式细胞仪检测CD11C+CFSE+细胞或HLA-DR+CFSE+细胞，计算CD11c+CFSE+细胞或HLA-DR+CFSE+细胞频率占总CFSE阳性细胞的频率,（Q2/Q1+Q2）x100%代表吞噬率。2结果2.1K562-MICA细胞的鉴定K562-MICA细胞的荧光强度显著增强，说明MICA抗原已经稳定表达在K562细胞表面（图1）。2.2凋亡的K562-MICA细胞对THP1细胞相关表型的影响在确定THP1表达CD14和CD11C细胞表面标记的基础上（图2）,观察THP1细胞表面CD86、MICA、HLA-DR、NKG2D表达的变化。结果显示,K562细胞刺激可微弱上调CD86、MICA、HLA-DR和NKG2D的表达。但与K562相比,K562-MICA细胞可刺激THP1上调CD86、MICA的表达，且CD86和MICA阳性的细胞频率近2倍增长而对HLA-DR、NKG2D的表达无明显影响（图3）。本实验重复2次。图1流式细胞术检测MICA在K562细胞的表达（阴影部分表示同型对照抗体标记，实线表示MICA抗体标记）图2THP1细胞高表达CD14和CD11C图3K562-MICA细胞刺激THP1上调表达CD86和MICA2.3K562-MICA细胞的凋亡小体对THP1细胞吞噬功能的影响本实验首先将K562、K562-MICA细胞经荧光素CFSE标记，进而用丝裂霉素C处理诱导凋亡,2者混合过夜后检测CD11C+CFSE+细胞的频率代表THP1细胞对凋亡小体的吞噬活性。结果发现,来自K562-MICA的凋亡小体更容易被THP1细胞吞噬（图4）。2.4来自K562-MICA细胞的凋亡小体对DC吞噬功能的影响与K562细胞相比，来自K562-MICA细胞的凋亡小体更容易被DC吞噬，且DC内吞噬的CFSE碎片荧光强度降低，提示这些碎片进入DC胞浆内已被及时加工处理(图5)。图4来自K562-MICA的凋亡小体促进THP1细胞吞噬图5来自K562-MICA细胞的凋亡小体易被DC吞噬2.5DC对K562-MICA细胞凋亡小体的吞噬依赖NKG2D受体尽管凋亡状态的K562细胞可上调DC表达NKG2D受体，但MICA在K562细胞表达后可协同刺激NKG2D的上调表达,尤其在细胞凋亡程度(丝裂霉素C30pg/mL)较为明显时,MICA的协同作用亦较为明显(图6)。在此基础上作者在DC与凋亡细胞的悬液中加入人NKG2D的中和性抗体，结果显示,NKG2D抗体可拮抗DC对K562-MICA细胞凋亡小体的吞噬作用(P<0.05),但并未下降到对K562细胞的水平，提示DC表面可能还有其他受体参与吞噬作用[7](图7)。图6K562-MICA细胞刺激DC上调表达NKG2D受体图7NKG2D抗体拮抗DC对K562-MICA细胞凋亡小体的吞噬活性3讨论本研究初步揭示了某些化学药物(如柔红霉素、硼替佐米等)治疗肿瘤的分子机制，因为这些药物在诱导肿瘤细胞凋亡的同时促进细胞表面表达MICA抗原。DC吞噬肿瘤细胞凋亡小体的意义不仅仅在于清除细胞碎片，更重要的是将肿瘤细胞来源的特异性抗原递呈给T细胞，诱导免疫记忆的产生,从而达到根治肿瘤的目的。NKG2D的配体除MICA抗原，还包括MICB和ULBP1~6分子。小鼠NKG2D还可识别视黄酸早期诱导蛋白-1(RAE-1),次要组织相容性抗原(H60)和鼠ULBP样转录子(MULT-1)。基于NKG2D配体表达谱的研究已证实,80%的上皮性肿瘤细胞表达MICA,而血液细胞来源肿瘤表达NKG2D的另一配体(ULBP)。然而由于免疫选择的压力(即免疫细胞清除MICA抗原高表达的细胞)，晚期肿瘤细胞表面MICA表达往往逐渐降低或丢失，造成免疫细胞不能识别肿瘤[8]。因此，通过某些化疗药物或基于MICA高表达的基因疫苗来提高肿瘤细胞表达MICA的密度，可作为肿瘤免疫治疗的手段之一。K562-MICA细胞来源的凋亡小体可明显促进DC表达NKG2D,而THP1细胞表面NKG2D的表达却没有明显变化。作者推测一方面可能与两种细胞处于分化的不同阶段有关,THP1处于早期的单核细胞阶段;另一方面,THP1为发生恶性转化的肿瘤细胞，与机体内正常细胞的生物学特征不完全一致。NKG2D一直被认为仅表达于淋巴细胞，但最近研究发现,DC或巨噬细胞在某些条件下可表达NKG2D。Baba等[9]报道大鼠体内CD4+CD8+巨噬细胞可表达NKG2D,通过识别肿瘤细胞表面MICA抗原而发挥抗肿瘤活性。Buhtoiarov等[10]发现小鼠初始巨噬细胞与L5178Y淋巴瘤细胞株及内毒素(LPS)共孵育后上调NKG2D受体的表达。K562-MICA细胞促进DC上调NKG2D表达的机制，推测可能与凋亡小体表面的危险信号(包括MICA抗原)分别与DC表面相关受体(如清道夫受体、DEC-205、TLR、NKG2D)结合，诱导DC活化有关。但在诱导NKG2D表达的刺激信号中娜一种信号发挥关键作用，仍然需要深入研究。参考文献ChampsaurM,LanierLL.EffectofNKG2Dligandexpressiononhostimmuneresponses[J].ImmunolRev,2010,235(1):267.JacobsB,UllrichE.TheinteractionofNKcellsanddendriticcellsinthetumorenvironment:howtoenforceNKcell&DCactionunderimmunosuppressiveconditions?[J].CurrMedChem,2012,19(12):1771.WehnerR,DietzeK,BachmannM,etal.Thebidirectionalcrosstalkbetweenhumandendriticcellsandnaturalkillercells[J].JInnateImmun,2011,3(3):258.SuzukiY,MimuraK,YoshimotoY,etal.Immunogenictumorcelldeathinducedbychemoradiotherapyinpatientswithesophagealsquamouscellcarcinoma[J].CancerRes,2012,72(16):3967.PathakSK,SkoldAE,MohanramV,etal.ActivatedapoptoticcellsinducedendriticcellmaturationviaengagementofToll-likereceptor4(TLR4),dendriticcell-specificintercellularadhesionmolecule3(ICAM-3)-grabbingnonintegrin(DC-SIGN),and阳integrins[J].JBiolChem,2012,287(17):13731.AsanoK,NabeyamaA,MiyakeY,etal.CD169-positivemacrophagesdominat