HPLC法测定双黄连注射液中黄芩苷的含量

HPLC法测定双黄连注射液中黄苓苷的含量【摘要】【目的】：探讨以HPLC法测定双黄连注射液中黄苓昔含量的方法，为测定其它成分作准备。【方法】：应用甲醇-水(10%的磷酸溶液调节pH至2.7)为流动相，流速为1.0ml/min,检测波长为326nm[1]，在Diamonsil(钻石)C18(5pm,150mmX4.6mm)色谱柱上洗脱，外标法定量，黄苓昔成分含量可测定。【结果】：双黄连注射液中黄苓昔在5.1〜81.6|Jg/ml范围内呈良好的线性关系，r=0.9998,平均加样回收率为100.34%，RSD=0.82%(n=5)。【结论】：该方法简便，灵敏，重现型好，结果准确，精密度较高，线性关系良好，回收率也较高，测定结果显示12小时内黄苓昔稳定，适合于双黄连的质量控制。【关键词】：双黄连注射剂；黄苓昔；高效液相色谱法DeterminationofbaicalininshuanghuanglianinjectionbyHPLC[ABSTRACT][Objective!:TodevelopaHPLCmethodforthedeterminationofbaicalininShuanghuanglianinjection,inordertodeterminingotherthings,wedothat.【Method】:ThecolumwaspackedwithDiamonsil(钻石)C18(5pm,150mmX4.6mm).Methanol-water(pH2.7)wasusdasmobilphase,theflowratewas1.0ml/min,andthedetectionwavelengthwassetat326nm.BaicalinwereseparatedbyHPLCwithgradeelution.[Results]:Themethodwaslinearwithintherangof5.1〜81.6pg/ml，r=0.9998,andtheaveragerecoverywas100.34%,withtheRSD=0.82%，(n=5).[Conclusions]:Themethodwassimple,accurate,highlysensitive,andreproducible.Italsohasthehighprecisionandrecovery,thelinearisgood,thedeterminationsolusionissteadywinthin12h,andissuitableforthequalitycontrolofShuanghuanglianinjection.[KeyWords]:Shuanghuanglianinjection，baicalin，HPLC,gradientelution.刖言：双黄连注射液是大剂量静脉点滴用的注射剂，具有良好的抗菌作用、抗病毒作用、抗解脲支原体作用及消炎清热的功能。在临床上主要用于急性上呼吸道感染、急性支气管炎、急性扁桃腺炎、肺炎及急性尿路感染等，其治疗结果确切、安全、有效，在临床上应用十分广泛[2]。是由金银花、黄苓、连翘三味中药提取制成的。其中黄苓的主要成分为黄苓昔、黄苓素、汉黄苓昔、汉黄苓素；具有抗肿瘤、降压、利胆、利尿、解毒及抗变态反应，抗肿瘤等作用[3][4]。金银花的主要成分为绿原酸、异绿原酸、咖啡酸、木樨草素；具有抗菌及增强免疫功能的作用、抗病毒作抑制溃疡作用[句血。连翘的主要成分是连翘昔(连翘昔是连翘中较晚认识的主要抗菌成分，也是其水溶性特征成分X连翘酯昔、连翘酯素；具有抗菌、抗炎、解热、抗病原微生物、抗肝损伤等作用⑺。双黄连注射液主要成分为黄苓昔、绿原酸、连翘昔。药理学已证实黄苓昔具有抑菌，清热、降压、镇静、利尿、利胆、抗炎、抗变态反应、解毒等作用；绿原酸抗菌消炎、清热解毒等作用；而连翘昔则具有较强的抑菌、抗病毒的活性。作为双黄连注射剂主要成分之一的黄苓昔是从由唇形科植物黄苓的干燥根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有多酚羟基结构，与酸碱作用具有多位反应点。其水溶性极小几乎不溶于水。难溶于甲醇、乙醇、丙酮,可溶于热乙酸。在高温和强碱性溶液中极不稳定，在低温和酸性条件下较稳定，但当PH值大于3时其稳定性也有所下降，故在不考虑其他因素作用下在提取和制剂的生产中黄苓昔的PH值应控制在3〜4之间，酸沉保温温度不宜太高。黄苓昔在有机溶剂中的稳定性较好，而在生物样品中稳定性较差。黄苓昔是黄苓的主要生物活性成份，其含量测定是控制黄苓质量的关键，具有抑菌、抗病毒、利尿、抗炎、抗变态、解痉和清除超声阴离子等作用，并且具有较强的抗癌反应等生理效能，是一种很有发展前途的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗变态等作用的生物活性成分。临床用于感染、肺炎、肝炎、高血压和先兆流产等疾病，在临床医学已占有重要地位。黄苓昔还能吸收紫外线，清除氧自由基，又能抑制黑色素的生成，因此既可用于医药，也可用于化妆品，是一种很好的功能性美容化妆品原料，具有较高的开发利用前景。黄苓昔含量测定的方法主要有高效液相色谱法、薄层扫描法、脉冲极谱法、黄苓昔-聚氯乙烯膜电极法、紫外分光光度法和毛细管电泳法[8][17].高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快及精准等特点，适合中

药成分的多样性及复杂性，在双黄连制剂的质量控制上应用也最多.本文通过优化色谱条件，测定黄苓苷的含量，方法简便、快速和准确，为进一步研究双黄连注射剂中绿原酸及其它成分打下基础，也为双黄连注射剂工艺研究和质量控制提供了有价值的手段.将对改善生产工艺，提高产品质量，减少药物的不良反应或过敏反应有重要的实际意义。仪器、材料和药品1.1仪器：TU—1800紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责公司），KQ-100型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FA1004HANGPING电子天平（上海精科天平），予华SHZ—D（III）循环水式真空泵（河南省巩义市英峪予华仪器厂），Diamonsil（钻石）C18色谱柱（5gm，4.6mmX150mmCat.no:9990Ser.no:8011571DikmaTechnologies迪马公司-色谱配件家），1.2材料：过滤器，微孔滤膜（孔径0.45gm，直径25mm），水膜（孔径0.45gm，直径50mm，北京北化黎明膜分离技术有限责任公司），有机膜（孔径0.45gm，直径50mm，天津津腾）,10ml一次性注射器。1.3药品：双黄连注射液（批号：Z23021166委托方：黑龙江乌苏里江制药有限公司；受托方：黑龙江乌苏里江佳大制药有限公司），黄苓苷化学标准品（批号110715—200514,供含量测定用，中国药品生物制品检定所），实验使用的甲醇为色谱纯（天津永大化学试剂开发中心，天津大茂化学试剂厂），其他为分析纯，甲醇（天津市北方天医化学试剂厂，天津市四通化工厂），磷酸（河北省保定化学试剂厂）。色谱条件：2.1流动相的制备2.11水（蒸馏水）用10ml移液管精密吸取磷酸（分析纯）10ml至100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，制成10%的磷酸液.用pH值为6.864的磷酸盐标准液校正pH计后，把蒸馏水放入合适的洁净干燥的烧杯，边用玻璃棒搅拌，边用胶头滴管滴加10%的磷酸液调节蒸馏水（蒸馏水的PH值约为3.4左右）的PH值至2.70，然后用水膜（0.45gm，50mm）过滤PH值为2.70的蒸馏水.2.12甲醇（色谱纯）用有机膜（0.45gm，50mm）过滤甲醇（色谱纯）.不能用水膜过滤，水膜溶于甲醇。2.2色谱条件Diamonsil（钻石）C18色谱柱（5gm，4.6mmX150mm），流动相:A-甲醇（色谱纯）:B-蒸馏水（50：50），流速为1.0ml/min,检测波长为326nm，进样量20以1。其分离色谱见图1~2。fflALI1£!图1图1黄苓苷化学标准品HPLC图图2样品HPLC图标准品溶液的配制：将电子天平预热30min后，精密称取黄苓苷标准品0.005100g至50ml容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容至刻度，超声至其完全溶解为止•配制成浓度为0.102mg/ml的储备液放入冰箱，低温储存.供试品溶液的配制：用0.1ml的移液管从双黄连注射液中精密吸取0.05ml至10ml容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容至刻度，超声10min使其溶解.再用0.45pm的滤膜过滤至用格酸洗液浸泡3小时并干燥好的10ml比色管中，扭紧塞子.线性关系考察：精密量取浓度为0.102mg/ml黄苓苷标准品储备液0.5、1、2、4、6、8ml分别至10ml容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容至刻度，配制成浓度为5.1pg/ml、10.2、20.4、40.8、61.2l、81.6pg/ml的一系列标准溶液后，再用0.45pm的滤膜过滤至用格酸洗液浸泡3小时后干燥好的6支10ml比色管中，扭紧塞子.按上述色谱条件进行测定，其中，保留时间约为25min左右，每个浓度的黄苓苷标准液测3次。根据3次峰面积的平均值，求黄苓苷的标准曲线。实验结果，黄苓苷在5.1〜81.6pg/ml浓度范围内呈线性关系，且线性良好.回归方程为A黄苓苷=41.409C-132.35,r=0.9998.如表一、图一：编号123456标准品的含量（pg/ml）5.110.220.440.861.281.6峰面积（1）118.555284.6696.21523.02375.23261.5峰面积（2）122.005281.1729.91524.42393.83269.5峰面积（3）122.878273.2695.11543.82386.33288.4平均峰面积115.5279.6707.11530.42385.13273.1表一、黄苓苷的线性关系考察实验数据黄苓苷标准曲线浓度R2=0.9996图3黄苓苷的标准曲线图加样回收率测定：浓度R2=0.9996用1.0ml的移液管从双黄连注射液中精密吸取1ml至100ml容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容，并超声10min使其完全溶解。再从此100ml容量瓶中取5ml至10ml容量瓶中，共五份，各精密加入黄苓苷标准品储备液0.051、0.102、0.204、0.306、0.357、0.510mg，用甲醇（分析纯）定容至刻度，并超声10min使其完全溶解，按上述色谱条件进行测定，其中，保留时间约为30min左右.根据峰面积，计算黄苓苷含量，并计算黄苓苷的平均加样回收率测。结果平均加样回收率测定为100.34%，RSD=0.82%。数据如：表二样品原含量/mg加样量/mg测得量/mg加样回收率/%平均加样回收率/%RSD/%0.35030.0510.4014100.140.35030.1020.451899.51100.340.820.35030.2040.552899.260.35030.3060.6605101.370.35030.3570.706999.89表二、黄苓苷的加样回收率实验数据7.精密度试验：取双黄连注射液1支，根据供试品溶液的配制法配制样品溶液1份，按上述色谱条件进行测定，其中，进样量20p1，保留时间约为30min左右.共进样5次。实验结果RSD=0.669%，见表三编号12345平均值RSD(%)峰面积1358.141377.471361.711354.191367.761363.850.669%表三、黄苓苷的精密度实验数据8.重现性试验：取同一批号双黄连注射液5支，根据供试品溶液的配制法配制样品溶液5份，按上述色谱条件进行测定，其中，进样量20p1，保留时间约为30min左右.实验结果RSD=1.03%，见表四编号12345平均值RSD(%)峰面积1415.801421.921405.411389.541391.121404.761.03%表四、黄苓苷的重现性实验数据9.稳定性实验：根据供试品溶液的配制法配制样品溶液一份，在室温下放置，于0h、3h、6h、9h、12h的时候按上述色谱条件测定一次峰面积，实验结果RSD=1.22%，表明黄苓苷在12h内稳定。时间（h）036912平均值RSD(%)峰面积1358.141350.761391.121373.141382.631371.161.22%表五、黄苓苷的稳定性实验数据10.样品含量测定：根据供试品溶液的配制法配制样品溶液，按上述色谱条件进行测定，其中，进样量20p1，保留时间约为30min左右.经实验测得双黄连注射液中黄苓苷的含量为7.1mg/ml。讨论：双黄连注射剂是由金银花、连翘、黄苓等中药经科学方法提取的无菌注射剂，其组方合理，是近年来中医临床常用的一种注射用中药制剂，也是我国应用时间较长的中药注射剂。主要功效为清热解毒，具有抗菌、抗病毒作用。它的应用，填补了抗生素过敏、耐药和病毒感染性疾病治疗上的空白，临床主要用于急性上呼吸道感染、疱疹性咽峡炎、急性喉炎、急性扁桃体炎、急性支气管炎和肺炎的治疗。双黄连注射剂于1990年投放市场，在1992年12月被国家中医药管理局指定为全国中医医院急诊(科)室首批急诊必备中成药。目前，该药已成为中国医院治疗上呼吸道感染疾病的首选药之一，其疗效已被全国各家报道肯定。然而，双黄连注射剂自1990年投放市场以来，与其他中药注射剂一样，随着临床应用的日益增多，不良反应的报道也逐年增加，甚至有严重不良反应，导致患者死亡。导致双黄连注射剂发生不良反应的原因很多，其中，药物本身问题也是一个重要原因。一方面，由于中药的成分极为复杂，且大多是复方制剂，其中的某些成分本来通过口服给药在消化道可被”分解"、"消化”、”排泄”，而经注射直接进入血液系统，就可能产生经口给药所没有的不良反应。或因个别批号药液纯度欠佳，而发生致热源反应；另一方面，药物成份本身可引起不良反应，如金银花中所含有的绿原酸和异绿原酸，不仅具有抗菌抗病毒作用，又具有致敏原作用，可引起变态反应，是引起过敏反应的主要原因之一。如童路口均报道双黄连针剂引起的过敏反应与黄苓甙有关，毒性反应与黄苓中的另一种成分有关。而也正因为如此，我们研究双黄连注射剂的成分及其质量控制方法，将对改善生产工艺，提高产品质量，减少药物的不良反应或过敏反应的重要实际意义。在进行高效液相色谱测定之前，我们用紫外分光光度计扫描双黄连注射剂中三种主要成分黄苓苷、绿原酸、连翘苷的最大吸收波长，结果发现黄苓苷有两个最大吸收峰,别为278nm及315nm；绿原酸在326nm处有最大吸收峰；连翘苷在205nm,229nm,278nm有最大吸收峰.与所参考的文献报道基本一致。由于黄苓苷在315nm处有最大吸收峰和绿原酸在326nm处的最大吸收峰相重叠，因此，在测定双黄连注射液时，用紫外分光光度法不能同时测定黄苓苷及绿原酸的含量，只能在278nm处单独测定黄苓苷的含量.至于连翘苷，有资深文献报道在进行双黄连注射液中的连翘苷含量测定时，曾试用HPLC法，但由于测得的连翘苷色谱峰峰型及分离情况均不理想，而没有采用HPLC法，一般都采用薄层扫描法。在薄层扫描法测定进行双黄连制剂中连翘苷的含量时,连翘苷的检测波长在530nm左右.黄苓苷与绿原酸的极性相差极大,在质量标准中也只规定二者含量分别测定，用HPLC法同时测定二者含量,多采用梯度洗脱法逐渐降低流动相极性的方法,而吸收波长一般选择326nm,以提高绿原酸的灵敏度.黄苓苷的HPLC测定，其流动相有甲醇:水:冰醋酸(5:50:1),甲醇:水:磷酸(50:50:0.2),异丙醇:甲醇:3%的醋酸(5:30:65),乙腈:1%乙酸,1.5%冰乙酸甲醇:0.5%三乙胺(75:25)系统，而在2005年版中国药典中黄苓苷的色谱条件与系统适用性试验为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：水：冰醋酸(50：50：1)为流动相检测波长为274nm，理论板数按黄苓苷峰计算应不低于1500。但我们在实验条件摸索过程中发现，流动相采用甲醇：水(用10%磷酸调节PH至2.7)，比例定为50：50时测定双黄连注射液中黄苓苷的含量的话，黄苓苷与注射液中其它组分分离良好，并且能减少磷酸盐对泵的侵蚀等，延长泵的寿命。在实验条件摸索阶段，我们原计划根据文献资料用梯度洗脱法同时测定黄苓苷及绿原酸的含量，但我们在整理所收集的绿原酸的资料发现：绿原酸是金银花、茵陈、杜仲等中草药既包括双黄连注射剂在内的中药复方制剂抗菌消炎、清热解毒的主要活性成分，目前已成为中草药制剂质量控制的主要指标之一.但绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，是由咖啡酸和喹尼酸缩合而成的缩酚醛，即咖啡酸喹尼酸酯，异名咖啡鞣酸.因而绿原酸不稳定，既能被酸也能被碱催化水解.有研究显示，绿原酸在有机溶剂中比较稳定.在乙醇中比在甲醇中更稳定(药典中测定样品中绿原酸含量时使用50%甲醇作溶剂)，更利于保存.而实验摸索时，我们也发现绿原酸标准品在室温下按相同的方法条件配制成标准品溶液进样，只间隔两天，绿原酸水解产生物质的峰已严重干扰绿原酸峰面积的测定.为条件所限，我们决定目前只测黄苓苷的含量，但仍把吸收波长定在326nm，以提高绿原酸的灵敏度(在双黄连注射剂中，绿原酸的含量较低，只相当于黄苓苷的6.5%左右)，为下一步用梯度洗脱法同时测定黄苓苷及绿原酸的含量提供经验.参考文献张华年，杨少芳，陈继业等.HPLC同时测定双黄连注射剂中氯原酸和黄苓苷2种指标成份含量.中国现代应用药学杂志，1999,16(6):47张洁，马百平，赵阳等.双黄连粉针剂指纹图谱中特征色谱峰的组成药味归属及定性.中成药，2005，27(12)：1365李砥晖，林天慕，张秀荣等.黄苓化学成分研究进展.空军医高专学报，1999，21(4)：231符洪，肖新月，张南平等.药用黄苓中主要化学成分分析.药物分析杂志，2003(23)：33刘晓河，甄攀，付全强等.金银花中绿原酸的高效液相色谱分析.张家口医学院学报，1