实验一蛋白质定量测定

生物化学实验

Biochemical

Experiment1实验目的掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能；培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。

绪论2通过生物化学实验应该做到学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。3.1实验记录实验前做好实验预习。实验中应及时准确地记录(事先在记录纸上设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量的数据。实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。

3实验记录与实验报告3实验记录与实验报告3.2实验报告实验报告的格式应为：⑴实验目的；⑵实验原理；⑶仪器、材料和试剂；⑷实验步骤；⑸结果讨论（含数理据处）；⑹注意事项;(7)思考题注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。4实验成绩评分方法平时成绩（20%）实验报告情况（30%）实验考试成绩（60%=理论30%+操作20%）实验一蛋白质定量测定常用测定方法1.凯氏微量定氮法2.紫外分光光度法3.双缩脲法4.Folin—酚试剂法(Lowry法)5.考马斯亮兰染色法紫外分光光度法蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。双缩脲法碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质－铜复合物（紫色）12/9/2022BiochemistryExperiments11Folin—酚试剂法(Lowry法)原理Step1碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质－铜复合物蛋白质－铜复合物使磷钨酸—磷钼酸还原蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可使酚试剂中的磷钨酸—磷钼酸还原而呈蓝色显色反应，蓝色。A500，540，660，700，750在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。Step2优缺点优点缺点操作简便灵敏度高费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线不是严格的直线形式，专一性较差，干扰物质较多可检测的最低蛋白质量达5µg/ml，通常测定范围是25~250µg/ml

试验结果的干扰因素干扰物质蔗糖Tris缓冲液硫酸胺酚类尿素柠檬酸胍硫酸钠三氯乙酸乙醇丙酮EDTAEGTATritonX-100dithiothreitol为了消除干扰因素的影响，用已知浓度的标准蛋白质进行实验，绘制标准曲线。Folin—酚试剂法(Lowry法)

实验目的（1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法（2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量一、器材[1]试管及试管架[2]移液管(5、1、0.5ml)、移液枪（0.2ml,用于样品蛋白质）[3]722型分光光度计[4]电热恒温水浴仪器试剂二、试剂[1]标准酪蛋白溶液：150μg／ml的标准酪蛋白溶液。[2]Fo1in—酚试剂甲[3]Fo1in—酚试剂乙[4]血清：稀释100倍。

一、Folin-甲由下述四种溶液配制：(1)4％碳酸钠溶液；(2)0.2N氢氧化钠溶液；(3)1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液；(4)2％酒石酸钾钠溶液。在使用前，将(1)与(2)等体积混合配成碳酸钠—氢氧化钠溶液，将(3)与(4)等体积混合配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后，将这两种溶液按50:1的比例混合，即为Fo1in—酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。

试剂二、Folin-乙在2000ml的磨口廻流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H20)100g，钼酸钠(Na2MoO4·2H20)25g，蒸馏水700ml，85％磷酸50ml和浓盐酸100ml，充分混合后，以小火廻流10h。再加入硫酸锂(LiSO4)150g，蒸馏水50ml及数滴液体溴。然后，开口继续沸腾15min，以驱除过量的溴。冷却后定容到1000ml，过滤，滤液呈绿色。

操作步骤：1.开电源预热20分钟2.调波长3.用黑体调T值(透光率）为0%4.用对照管的溶液调A值（吸光率）为0%。5.测各浓度的标准蛋白质和血清蛋白质的A值。取6支试管（平行两份），分别加入0，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80ml标准酪蛋白溶液(150μg／ml)，用水补足1.00ml。按顺序向各管加入5mlFo1in—酚试剂甲，混匀。30度下放置10min。再依次向各管加入0.5mlFolin—酚试剂乙，立即摇匀，在30℃保温(或室温下放置)30min。然后，在500nm处，在722型分光光度计上进行比色测定，多测几次，并取其平均值。以光密度(A)为纵坐标，以酪蛋白溶液浓度为横坐标，在方格坐标纸上作图，绘制出酪蛋白的标准曲线。

操作步骤1.标准曲线的制作反应物(ml)0（空白对照管）12345蛋白质标准溶液(500µg/ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水ml1.00.80.60.40.21.0Folin-酚甲ml5.05.05.05.05.05.0Folin-酚乙ml0.50.50.50.50.50.5A(500nm)蛋白质浓度(mg/L)0混匀后30度水浴锅中放置10min取6支试管

立即摇匀，室温下放置30分钟后以0号试管为空白对照，在500nm处比色操作步骤1.标准曲线的制作制作标准曲线：以A500为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标

标准蛋白浓度=标准液(mL)×标准液浓度（500ug/ml）/1.0030456090120ug/ml取2支试管，各加入一定量的血清稀释液(已经稀释100倍，其蛋白质含量在酪蛋白标准曲线范围之内)，本实验取0.2ml血清稀释液，再加入0.8ml蒸馏水使样品体积达到lml。其他操作与“标准曲线的制作”相同。

操作步骤2.血清蛋白质浓度的测定反应物(ml)0（空白对照管）12血清稀释液(已经稀释100倍)00.20.2蒸馏水ml1.00.80.8Folin-酚甲ml5.05.05.0Folin-酚乙ml0.50.50.5A(500nm)蛋白质浓度(mg/L)0混匀后30度水浴锅中放置10min取3支试管

立即摇匀，30分钟后以0号试管为空白对照，在500nm处比色2.血清蛋白质浓度的测定制作标准曲线：以A500为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标

标准蛋白浓度=标准液(mL)×标准液浓度（150ug/ml）/1.0根据待测血清蛋白样品的A值（y轴）查找相对应的x轴数值求得蛋白质浓度。030456090120ug/ml思考题1.folin-酚测定蛋白质的原理是什么2.有哪些因素可干扰folin-酚测定蛋白质含量？实验二SDS(聚丙烯酰胺)凝胶电泳分离蛋白质一、实验目的掌握SDS的工作原理和操作方法二、原理不同蛋白质具有不同的分子量，并在一定的pH溶液中带有不同的电荷。但经过SDS处理后的蛋白质，分子表面完全被负电荷所覆盖，因此在电泳时，电泳迁移率近取决于蛋白质的分子量大小而与其所带电荷的性质无关。1聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）→（催化剂）→聚合催化剂：过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED）改变单体和交联剂浓度可改变凝胶孔径2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。SDS处理前必须用巯基乙醇完全打开蛋白质之间的二硫键，使蛋白质分子被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上。

蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，因此在进行电泳时，向阳极移动。图1标准蛋白质与待测样品电泳图谱

940006200043000310002010014400胶槽123注：胶槽1标准蛋白；胶槽2、3样品蛋白得到同行专家赞3.蛋白质分子移速度取决于分子大小。当分子量在15000KD到200000KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。4.分类PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类：1.连续系统：2.不连续系统：不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝胶，用不同pH值的缓冲液：浓缩胶：大孔径，pH6.7～6.8Tris-HCl缓冲液分离胶：小孔径，pH8.8～8.9Tris-HCl缓冲液三、实验试剂和器材1.低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌动蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制剂MW=20,100

鸡蛋清溶菌酶MW=14,400

置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。2.样品：3mg未知蛋白质1+3mg未知蛋白质2，加4ml蒸馏水溶解。3.30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr29g，甲叉双丙烯酰胺

（Bis）1g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中4.10%SDS（十二烷基磺酸钠）5.10%过硫酸铵(AP)6.TEMED（四甲基乙二胺）7.2x上样缓冲液：10%SDS（4ml）+巯基乙醇（1ml）+0.2%溴酚蓝（2ml）+甘油2ml+1MpH6.8Tris-HCl（1ml）8.浓缩胶缓冲液（1MTris-Cl缓冲液pH6.8）9.分离胶缓冲液（1.5MTris-Cl缓冲液pH8.8）10.固定液：取乙醇500ml，冰乙酸100ml混匀，定溶至1000ml。11.染色液：称取考马斯亮蓝R2501.25g，甲醇225ml，冰乙酸50ml，双蒸水225ml.12.脱色液：冰乙酸80ml，乙醇250ml，加蒸馏水定容至1000ml。13.电泳缓冲液（SDS20g，Tris60g,甘氨酸282.2g,pH8.3）加蒸馏水使其溶解后定容至2000ml。

实验器材垂直板电泳装置电泳仪支胶架移液枪移液管烧杯培养皿电炉四、实验步骤

1.安装膜具

1）将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,将凡士林均匀的涂在两侧的封条上，用封条将玻璃板封好。

2）称取2g琼脂糖加100ml蒸馏水，慢慢的煮开（煮的过程中要不断搅拌），将煮好的(无气泡)琼脂糖倒入支胶架三分之二高度，快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中，注意凹槽朝外，用夹子固定好，待凝固后灌胶。

2.制备SDS聚丙烯酰胺凝胶

1）制备分离胶30%丙烯酰胺5ml+分离胶缓冲液5ml+10%SDS0.2ml+10%过硫酸铵0.2ml+蒸馏水9.6ml;混匀后加入8ulTEMED,立即混匀（不能有气泡），灌入安装好的垂直板中，灌胶时要匀速贴壁流入，防止气泡产生。灌至离槽沿3cm处，立即在胶面上用

移液管加入1-2cm的蒸馏水，静止，待凝胶聚合后（约30min），去除水相，然后用吸水纸吸干残余的水。

2）制备浓缩胶30%丙烯酰胺1.32ml+浓缩胶缓冲液1ml+10%SDS0.08ml+10%过硫酸铵0.08ml+蒸馏水5.6ml;混匀后加入8ulTEMED,立即混匀（不能有气泡），灌入垂直板至离槽沿0.5cm处，插入梳子（不能混入起泡），静止，待凝胶聚合后，加入电泳缓冲液，拔去梳子。3）先用刀片将琼脂糖剥离开，再将玻璃板从架子上取出，再用夹子固定在电泳槽内（注意凹槽朝内），将电泳缓冲液倒入电泳槽内。

3.样品预处理

4.上样

1）第一个孔内加20ul标准蛋白质溶液

2）其他每孔加入20ul样品。上样时要将移液枪头垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品

5.电泳

接通电源，将电压调至80V、50mA。当溴酚兰进入分离胶后，把电压提高到150V、80mA，电泳至溴酚兰距离胶底部1-2cm处，停止电泳

6.固定

取下凝胶，置于培养皿中的固定液中，轻轻振摇10分钟，倒去固定液

7.染色脱色

培养皿中倒入50-60度预热的染色液浸没凝胶，约40分钟后回收染色液，用清水冲洗掉胶上多余的染色液。倒入脱色液，防止2小时，期间换脱色液2-3次图1标准蛋白质与待测样品电泳图谱

五、实验结果分析

940006200043000310002010014400胶槽123注：胶槽1标准蛋白；胶槽2、3样品蛋白六、思考题该实验中如何去除蛋白质间电荷效应的？在不连续体系SDS中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?实验三

酵母RNA的分离及组分鉴定

一、实验目的(1)学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法。(2)了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。二、实验原理酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。

核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。

三、仪器、材料和试剂实验仪器1．乳钵

2．150mL锥形瓶

3．水浴

4．量筒

5．布氏漏斗及抽滤瓶

6．吸管

7．滴管

8．试管及试管架

9．烧杯

10．离心机

11．漏斗。实验试剂

1．氯化铁浓盐酸溶液

2．苔黑酚乙醇溶液

3．定磷试剂

（1）17％硫酸溶液

将17mL浓硫酸(比重1