MALDITOFTOFMS在蛋白质组研究中的应用课件

MALDITOF/TOFMS在蛋白质组研究中的应用

张养军军事医学科学院反射与辐射医学研究所北京蛋白质组研究中心2009年4月.MALDITOF/TOFMS.1报告内容：一、蛋白质组学简介二、生物质谱用于蛋白质组鉴定的基本原理三、MALDITOF/TOFMS仪器组成和基本原理四、MALDITOF/TOFMS在蛋白质组研究中的应用1、在表达谱构建中的应用2、在翻译后修饰研究中的应用3、在蛋白质相互作用研究中的应用4、在蛋白质相对和绝对定量研究中的应用.报告内容：.2一、蛋白质组学简介蛋白质组（proteome）：一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质。蛋白质组学（proteomics)：研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成、定位、变化及其相互作用规律的科学。简要历史回顾：1994年，澳大利亚的科学家首次提出蛋白质组概念；1995年，蛋白质组一词首次见诸报端；2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织(HumanProteomeOrganization,HUPO)，随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，期望共同努力，完成人类蛋白质组计划(HumanProteomeProject)；另外，创刊了蛋白质组学专门杂志，如《Proteomics》、《Molecular&cellularproteomics》和《Journalofproteomeresearch》；2002年～现在，已举行了六届HUPO国际会议和五届中国蛋白质组学术大会。.一、蛋白质组学简介.3蛋白质组研究的意义1、一些物种如小鼠、大鼠等基因组测序工作的完成，特别是人类基因组计划草图完成（2001年）后，人们面临的迫切任务之一便是对基因组的功能注释，而在基因组和转录组水平上常常无法回答许多生物学问题，如基因转录和翻译的起始位点、翻译后修饰种类和位点、定位信息以及相互作用等问题，因此，蛋白质组的研究是基因组研究的深入和延续；2、作为生命功能的执行体——蛋白质组的研究是为了从更高层次上深入解读生命的本质和生命活动的规律。3、通过人类疾病蛋白质组的研究，为病理研究、早期诊断、治疗以及药物开发提供依据。.蛋白质组研究的意义.4蛋白质组学研究的内容1、蛋白质组表达谱(proteomeexpressionprofiling)针对已有基因组或转录组数据库的生物体、组织或细胞，建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库。2、蛋白质组修饰谱(proteomemodificationprofiling)构建蛋白质翻译后修饰的种类、修饰位点以及修饰官能团的结构等数据库。3、基本生物学问题研究与生命活动过程中密切相关的问题。比如：蛋白质组成和空间结构、定位和相互作用网络等；.蛋白质组学研究的内容.54、临床应用问题以重要的生理过程或人类一些重大疾病为对象，进行重要的生理和病理体系或过程的研究，即进行比较蛋白质组学研究，包括疾病发生和发展机制、疾病诊断标志物以及药物靶标等；

5、蛋白质组学中的新技术和新方法建立蛋白质组学研究的支撑技术平台以及生物信息学研究工具，包括各种定性、定量、结构分析和生物信息学软件和数据库。.4、临床应用问题.6

蛋白质组研究中的复杂性一种细胞、组织或生物体有多少蛋白质?人类基因组含有3～4万个基因，与小鼠的基因数相差不多，仅是果蝇或线虫的两倍左右，但他们的表型相差却如此巨大，其根本问题便是蛋白质组的差异所致。30000-40000个基因30000个基因共享99%基因.蛋白质组研究中的复杂性30000-40000个基因37PosttranslatedmodificationInteractionConformationtransformationPosttranslatedsplicingDisplacementcytoplastnuclei蛋白质多样性一个基因表达多少种蛋白质？.PosttranslatedInteractionCon8

对于人体：

1个受精卵发育成1012细胞，103细胞类型。其“蛋白质组”随“时”、“空”处于变化之中，而“基因组”则相对处于不变之中。因此，我们可以得出：生命体的统一性源于基因组，生命体的复杂性源于蛋白质组。.对于人体：.9主要研究策略1、研究基础（1）生物学的发展，特别是越来越多生物基因组测序的完成，为我们提供了蛋白质组数据库；（2）生物质谱和分离科学的进步为我们提供了分离和鉴定的技术平台和必须的手段；（3）计算机技术的提高，特别是生物信息学的发展为我们处理海量数据提供了有力的支持和保障。.主要研究策略.102、蛋白质组学研究方法分类（1）蛋白质组定性分析

依据分析对象是整体蛋白质混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白质组的定性分析方法分为自下向上法（bottomup）和自上向下法(topdown)；依据蛋白质的序列特征，蛋白质组定性分析方法可分为：肽质量指纹谱法（PMF)和肽序列标签法（PST,也叫denovo法）

.2、蛋白质组学研究方法分类.11（2）蛋白质组定量分析方法①直接进行比较，包括SDS、2DE、HPLC；②标记方法，包括同位素标记亲和标签（ICAT，iTRQA）、元素标记亲和标签（ECAT）、酶促18O标记、DYGE技术和同位素氨基酸细胞培养标记(SILAC)。.（2）蛋白质组定量分析方法.123蛋白质组研究方法进展(1)复杂蛋白质组体系

目前对于组织、细胞和血浆等复杂蛋白质组的分析，均采用多维分离技术与质谱联用的方法。其技术路线如图1和图2所示。.3蛋白质组研究方法进展.13细胞、组织或体液蛋白质提取液整体蛋白质混合物预分离包括：2DE，2DLC，或LC-SDS等不同馏分或蛋白质电泳带多肽混合物溶液酶切或胶上原位酶切PMF，PSTORDENOVO数据蛋白质组MALDIMSorMSMSorcLC-ESI-MSMS

生物信息学工具图1整体蛋白质组预分离分析技术路线超声、离心处理或亚细胞器分级.细胞、组织或体液蛋白质提取液整体蛋白质混合物预分离包括：不同14细胞、组织或体液蛋白质提取液多肽混合物PSTORDENOVO数据蛋白质组MALDIMSMSorc2DLC-ESI-MSMS

生物信息学工具

图2多维蛋白质组分析技术（鸟枪法蛋白质组学方法）

超声、离心处理或亚细胞器分级溶液酶切.细胞、组织或体液蛋白质提取液多肽混合物PSTORDEN15BenjaminF.Cravatt,GabrielM.Simon&JohnR.YatesIII,Thebiologicalimpactofmass-spectrometry-basedproteomics.NATURE,Vol450:991-1000(2007)A.J.Link,J.EngD.M.Schieltz,E.Carmack,G.Mize,D.R.Morris,B.M.Garvik,J.R.Yates,III,Directanalysisofproteincomplexesusingmassspectrometry,NatureBiotechnology17,676-682(1999)

（JohnR.YatesIII，TheScrippsResearchInstitute

）鸟枪法蛋白质组学方法可形象图示为:.BenjaminF.Cravatt,GabrielM16(2)简单的蛋白质组体系对于特定的、简单的蛋白质组分析，既可采用多维分离技术与质谱联用的方法，也可以采用较少步骤的分离和质谱联用技术。其技术路线如图3所示。.(2)简单的蛋白质组体系.17细胞或组织蛋白质提取液整体蛋白质混合物分离SDS，IEF，HPLC不同馏分或蛋白质电泳带多肽混合物溶液酶切胶上原位酶切PMF，PSTORDENOVO数据蛋白质组MALDIMSMS,cLC-ESI-MSMS

生物信息学工具图3特定或目标蛋白质组分离分析技术超声、离心处理或亚细胞器分级.细胞或组织蛋白质提取液整体蛋白质混合物分离不同馏分或蛋白质电18(3)数据标准为确保蛋白质组数据的可靠性，以《Molecular&CellularProteomics》为代表的蛋白质组学专业杂志对蛋白质组数据产出、处理、质量控制和发表提出了严格的要求，具体包括：实验方法、数据处理程序名称和版本、蛋白质数据库和版本、数据判断的阈值和统计方法、蛋白质的名称、序号和覆盖率、肽段的序列和分值等。另外，数据可靠性评价标准：如概率法、反转数据库法等评价方法已获得广泛应用。.(3)数据标准.19(4)、蛋白质组技术方法发展趋势蛋白质组研究中目前面临的技术挑战主要是：标准化方法的验证以及数据的精确性和重现性、简便有效的验证技术和定量技术。就技术本身而言仍然是分析化学的基本问题即选择性、准确性、灵敏性、重现性、可行性和动态范围。具体包括：1、标准化、高灵敏度和高重现性的微量蛋白质组学分析方法的建立及验证和评价体系；2、“鸟枪”蛋白质组学方法向“导弹”蛋白质组学发展，即基于中心法则和转录组数据，直接鉴定相关蛋白质组，而不是随机鉴定蛋白质组；.(4)、蛋白质组技术方法发展趋势.20

“鸟枪”蛋白质组学方法基于肽段水平上“随机”捕获肽段，籍此对其相应的蛋白质进行鉴定，其结果具有不确定性、不具有目标性以及低的重现性；而“导弹”蛋白质组学发展，即基于中心法则和转录组数据以及文献数据，直接鉴定相关蛋白质组，其结果是具有明确的目标性、高的重现性和鉴定效率。

“鸟枪”蛋白质组学方法就像在大海中捞鱼，如图A，而“导弹”蛋白质组学方法就像导弹打卫星，如图B所示。.“鸟枪”蛋白质组学方法基于肽段水平上“随机”捕获肽段21图B“导弹”蛋白质组学方法示意图图A“鸟枪”蛋白质组学方法示意图.图B“导弹”蛋白质组学方法示意图图A“鸟枪”蛋白质组学方22肝组织蛋白质混合物酶切

多肽混合物SCXRPLC二维色谱分离MS/MSCollisionCellMS1P1P2P3…PnMS1P2P9P5…PmSHOTGUNMISSILESHOTGUN:不确定性、不具有目标性以及低重现性MISSILE:明确的目标性、高重现性和高鉴定效率.肝组织蛋白质酶切多肽SCXRPLC二维色谱分离MS/MSC233、规模化高灵敏度、高重现性和宽动态范围的蛋白质组定量方法的建立与科学合理的新算法；4、蛋白质组功能模块定量、动态、实时检测、成像和标识技术的建立和应用；5、集成物理、化学和信息技术中的标记技术、示踪技术、传感技术和成像技术，建立动态目标蛋白质组的表达、修饰、定位和相互作用可视技术；6、建立生物标志物发现、MRM验证定量和临床标志物检测的标准化方法。.3、规模化高灵敏度、高重现性和宽动态范围的蛋白质组定量方法的24二、生物质谱用于蛋白质组鉴定的基本原理

自从1912年，Thomson首次使用抛物线质谱仪测定了Ne的两种同位素22Ne和24Ne以来，经过近100年的发展，质谱在其各个方面都得到巨大的发展（如下图所示），各种组合的质谱仪不断出现，应用更加深入广泛！真空系统进样系统离子源质量分析器检测器

供电系统

数据处理与控制系统.二、生物质谱用于蛋白质组鉴定的基本原理真空系统进样系统离子源25离子源

离子源的作用：将样品中的原子、分子电离成为离子，并使这些离子在离子源系统中形成具有一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被分离。有机质谱常用的离子源有：电子轰击离子源（EI）；对热不稳定或高分子量化合物有化学电离源（CI）；解吸化学电离源（DCI）；场电离源（FI）；场解吸电离源；快原子轰击电离源（FAB）；离子轰击电离源（IB）；激光解吸电离源（LI）；热喷雾和电喷雾电离源（ESI）等。生物质谱常用后两种离子源。.离子源.26质量分析器

质量分析器的作用：使离子按照质荷比的大小分离开来，以便得到按质荷比大小顺序排列成的质谱图。有机质谱和生物质谱常用的质量分析器有：a磁场(或电场)质量分析器；b四极杆质量分析器；c飞行时间质量分析器；d离子阱质量分析器；e离子回旋共振质量分析器；fORBITRAP（轨道离子阱）。.质量分析器.27质量分析器、缩写符号和原理.质量分析器、缩写符号和原理.28生物质谱用于蛋白质鉴定的基本假设：（1）蛋白质的组成是唯一的，即蛋白质具有一个、数个肽段或一组肽段作为其标签；（2）存在选择性地对蛋白质进行酶切的一种或多种蛋白酶；（3）通过生物质谱获得的肽段的质荷比信息可以推测出肽段、蛋白质的序列或直接通过与蛋白质序列数据库中蛋白质参数及相关肽段信息的比对和相关分析鉴定蛋白质。.生物质谱用于蛋白质鉴定的基本假设：.291、肽质量指纹谱（PeptideMassFingerprinting，PMF）指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽段混合物经过质谱分析所得到的质谱图。由于组成每种蛋白质的氨基酸序列(一级结构)不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具特征性，所以称为肽质量指纹谱，籍此可以实现对蛋白质的鉴定。蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后的肽质谱图.1、肽质量指纹谱（PeptideMassFingerpr30各种蛋白酶的切点及pH条件

蛋白酶切点pH条件TrypsinLys(K)、Arg(R)羧基端pH7.5-9.0Glu-CAsp(D)、Glu(E)羧基端pH4.0Glu(E)羧基端pH7.8Asp-NAsp(D)氨基端pH7.0-8.0Arg-CArg(R)羧基端pH7.2-8.0Lys-CLys(K)羧基端pH8.5-8.8.各种蛋白酶的切点及pH条件蛋白酶切点pH条件Trypsi312、肽序列标签(peptidesequencetag,PST)选择蛋白质的一种或数种肽序列标签肽段，在质谱裂解池中碎裂而获得相应碎片肽段的质谱图，籍此推断或比对出该肽段的序列，进而鉴定出产生该肽段的蛋白质（该方法也叫denovosequencing

）。多肽串联质谱碎裂方式示意图

.2、肽序列标签(peptidesequencetag,32多肽串联质谱碎片离子结构示意图.多肽串联质谱碎片离子结构示意图.33鸡卵白蛋白磷酸肽（EVVGSAEAGVDAASVSEEFR）m/z2088.9的ESI-Q-TOF串联质谱图.鸡卵白蛋白磷酸肽（EVVGSAEAGVDAASVSEEFR）34鸡卵白蛋白磷酸肽m/z2088.9串联质谱理论值及检索匹配值“*”m/zmatchedwithMascotsearchresult,“_”m/zmatchedwithcalculatedvalues.鸡卵白蛋白磷酸肽m/z2088.9串联质谱理论值及检索匹353、肽阶梯测序法（PeptideLadderSequencing）（1）多肽经化学或酶法处理，从肽链末端氨基酸起逐一降解产生一系列长度递减的肽；（2）每一步反应只水解最末端的氨基酸，产生的一系列肽相邻质量之间相差一个氨基酸残基的质量；（3）用质谱检测反应不同时间点的降解产物，得到肽的阶梯图，根据相邻肽之间质量数之差值推出肽段的部分序列；（4）羧肽酶和氨肽酶，分别从肽链的C末端和N末端水解氨基酸或对肽段的一段进行标记使质谱仅产生一种y或b离子序列；（5）既可以采用手工也可以借用计算机软件推断肽序列；.3、肽阶梯测序法（PeptideLadderSequen36（6）对蛋白质全序列，一般需要多种酶产生多种不同的肽段混合物，分别测定每种混合物中肽的序列；（7）人工拼接或借助于计算机软件进行拼接，完成蛋白质全序列全序列测定。如右图所示：通过相邻质谱峰的差值可推断出氨基酸残基，但对同分异构的氨基酸需进一步的结构分析，如亮氨酸和异亮氨酸.（6）对蛋白质全序列，一般需要多种酶产生多种不同的肽段混合物37三、MALDITOF/TOFMS仪器组成和基本原理.三、MALDITOF/TOFMS仪器组成和基本原理.384700/4800ProteomicsAnalyzer

(美国ABI公司）1、MALDITOF/TOFMS仪器组成.4700/4800Proteomics1、MALD39LaserSampleLoadingChamberCameraLamp4800MALDITOF/TOF™AnalyzerSchematicSamplePlateandStageMirrorsLinearDetectorReflectorDetector2-StageMirrorMirrorDeflectorsDecelDeflectorsX2,Y2DeflectorsX1,Y1DeflectorsTISCollisionCellMetastableSuppressorSource2DecelStackSource1Source1LensLens1CIDLens(Lens2)Lens3Attenuator.LaserSampleLoadingChamberCam40V2V1Laser

Source1Source2x1,y1DeflectorsReflectorDetector2StageReflectorCIDCellMetastableIonSuppressorLens1AttenuatorTISTOF2

x2,y2DeflectorsSamplePlateTOF1

LinearDetector(optional)DecelerationStackx3,y3DeflectorsLens2IonSink4700MALDITOF/TOF™AnalyzerSchematic.V2V1LaserSourc412、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱原理

（Matrix

Assisted

Laser

Desorption

Ionization

Time

ofFlightMassSpectrometry,MALDI-TOF-MS)HighvacuumMALDI-TOF-MS仪器结构示意图.2、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱原理Highvacuu42飞行时间(TimeOfFlight,TOF)质量分析器基本原理：离子源产生的离子在加速电场获得动能，进入高真空无电场飞行管道并在此无场飞行管道内飞行；质量较轻的离子飞行速度快，较早到达检测器；质量较重的离子飞行速度慢，较晚到达检测器。依据离子的飞行时间与其质荷比平方根(m/z)成正比的关系，通过测定飞行时间，计算出相应离子的原子量或分子量。

.飞行时间(TimeOfFlight,TOF)质量分析43线性飞行时间质谱(Liner-TOF)

由

E=VS·ze=1/2mv2和

t=L/v推出

t=const·m/z

E：离子在加速电场获得的动能;VS

：加速电场电压

z：离子所带电荷;m：离子质量，

v：离子飞行速度;L：飞行管道长度，

t：离子飞行时间;const：常数。

.线性飞行时间质谱(Liner-TOF)

.44MALDITOFMS的特点：1、高灵敏度（高的离子传输效率）2、宽质量范围(400Da-400kDa,理论上没有上限)3、分析速度快4、容易校正5、PSD或MS/MS(HIGH/LOWENERGYCOLLISION).MALDITOFMS的特点：.45影响TOF分辨率的因素：分辨率公式：其中：m和t分别为离子的质量和飞行时间；△m和△t分别是质量和时间坐标时半峰宽质量和时间；△x为到达检测器的离子簇的厚度。.影响TOF分辨率的因素：分辨率公式：其中：m和t分别为离子46从以上公式可以看出：提高TOF质量分析器的措施包括延长飞行管和增加飞行时间。延长飞行时间会造成因与其他气体离子碰撞引起散射或离子束角扩散，降低TOF质量分析器性能；增加飞行时间意味着降低加速电压，如此会降低灵敏度。所以，一般选择飞行管1～2m，加速电压20kV。另外，影响TOF分辨率的还有形成离子时的时间分散；离子占有空间体积的空间分散和动能不均的动能分散。为了有效解决这些问题，出现了两种关键技术：延迟脉冲提取技术和反射技术。.从以上公式可以看出：提高TOF质量分析器的措施包括延47延迟提取技术：

为了减少离开离子源、具离有相同m/z离子的动能分散，我们在离子形成和提取之间引入一段时间延迟。如下图所示，初始形成的离子首先进入源中的无场区，数百纳秒到微秒后施加脉冲电压，这种操作方式叫做延迟脉冲提取技术。这种能量聚焦的关键就是在离子形成和提取之间能够适当调节脉冲电压的大小和延迟时间的多少。一般对于较低的m/z离子，可选择较低的电压或较短的延迟时间。需要注意的是延迟提取技术仅能改善一定质量范围离子的分辨率，且对高质量的离子不是非常有效。.延迟提取技术：.48连续提取和延迟脉冲提取技术示意图连续提取延迟提取延迟提取技术使质谱峰明显变窄，因此分辨率显著提高.连续提取和延迟脉冲提取技术示意图连续提取延迟提取延迟提取技术49反射技术安装反射镜TOF质谱仪示意图图中：实心点表示相同m/z带有较大的动能空心点表示相同m/z带有较小的动能.反射技术安装反射镜TOF质谱仪示意图.50（1）（2）（3）（4）在反射场中飞行总时间在飞行管中飞行的总时间：总飞行时间与线性TOF原理的数学表达式相同.（1）（2）（3）（4）在反射场中飞行总时间在飞行管中飞行的51采用反射镜技术后如何达到能量聚焦

假设具有相同质荷比但带有不同动能的两种离子，其中一个动能为Ek，另一个的动能为E’k，且两个离子的动能比为a2，即：（1）我们推导出两个离子的总飞行时间分别为：（2）.采用反射镜技术后如何达到能量聚焦（1）我们推导出两个离子的总52由公式（2）看出：如果a＞1，那么带有较多动能的离子在无场飞行管中的飞行时间较短，而在反射镜中的飞行时间较长；对于a＜1的情况，结果正好相反。这种飞行时间在两个飞行部分相互补偿，最终使具有相同质荷比但不同动能的离子具有相同的总的飞行时间而同时到达监测器。需要注意的是增加反射镜虽然没有增加质谱仪的尺寸，但其提高分辨率是以牺牲质谱的灵敏度和降低检测质量范围为代价的。.由公式（2）看出：如果a＞1，那么带有较多动能的离子53TOF/TOF质谱（TandemSpectrometerwithCID）IonSource#2IonSource#1PrecursorIonSelector(TIS)CollisionCellMassAnalyzer#2DetectorMassAnalyzer

#1GeneratesandAcceleratesIonsTOF1SeparatesIonsInducesCIDFragmentationofPrecursorRe-AcceleratesFragmentsTOF2withMirrorSeparatesFragmentsSelectsIons.TOF/TOF质谱（TandemSpectrometer54如何实现MS/MS分析？凭借时间离子选择装置（Timed-Ion-Selector，TIS)选择母离子，在CID中与一定压力的惰性气体分子发生碰撞得到碎片离子，然后进行TOF分离和检测。

TIS具有两种功能：一是可以抑制来自基质和样品中不感兴趣的低质量的离子；二是为MS/MS分析选择母离子。操作步骤：依据选择离子达到的时间适时的施加电压（关门）偏转离子的飞行轨道或接地（开门）使离子通过。.如何实现MS/MS分析？.55Timed-Ion-SelectorVoltageDetectorDetectorOutputTimeIntensity+++Mass50Mass100Mass500Mass50AccelDrift+++Time=0-+.Timed-Ion-SelectorVoltageDetec56TimedIonSelectorVoltageDetectorMass50Mass100Mass500DetectorOutputMass50TimeIntensityAccelDriftTime=A-++++Mass50Mass100Mass500Mass50.TimedIonSelectorVoltageDetec57TimedIonSelectorTime=BVoltageDetectorDetectorOutputTimeIntensityAccelDrift+++Mass50Mass100Mass500Mass50.TimedIonSelectorTime=BVolt58TimedIonSelectorVoltageDetectorDetectorOutputTimeIntensityAccelDriftTime=C-+C+++Mass50Mass100Mass500Mass50.TimedIonSelectorVoltageDetec59TimedIonSelectorVoltageDetectorDetectorOutputTimeIntensityAccelDriftTime=D+-C+++Mass50Mass100Mass500Mass50.TimedIonSelectorVoltageDetec60Pulsedlaser3.Ionsareacceleratedbyanelectricfieldtothesamekineticenergy;theyseparateaccordingtomassastheydriftthruthefield-freeregionoftheflighttubeFlighttube1.

Sample+matrixdriedontargetplateHighvacuumTimeHighvoltage2.Sampleisirradiatedwithlaser,clockstartstomeasuretime-of-flight

20-25kV5.Adatasystemcontrolsinstrumentparameters,acquiressignalvs.time,andprocessesthedata4.Ionsstrikethedetectoratdifferenttimesdependingonthemass/chargeratio一般MALDI质谱的分析步骤.Pulsedlaser3.Ionsareaccel61离子源基质辅助激光解吸电离(MALDI)基本原理：将分析物分散在基质(Matrix)分子中并形成共结晶,当用激光(337nm的氮激光或355nm的固体激光器)照射晶体时,样品分子获得激光能量解吸附，基质－样品之间发生电荷转移使样品分子电离。离子源特点1、使用脉冲式激光；2、产生单电荷离子和部分双单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关系；3、离子化效率高，是现今灵敏度最高的质谱仪(fmol～amol)。.离子源基质辅助激光解吸电离(MALDI)基本原理：将分析物分62

基质1、吸收了激光的大部分能量并气化，同时将样品分子带入气相。样品分子只吸收少量激光能量，避免了分子化学键的断裂。2、基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品分子带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子。.基质.63基质简称中文名称英文名称激发波长SA芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)Sinapinicacid(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid)

337nm或355nmDHB龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸)Gentisicacid(2,5-dihydroxybenzoicacid)CHCAα-氰基-4-羟基肉桂酸α-cyano-4-hydroxycinnamicacidPA吡啶甲酸Picolinicacid3HPA3-羟基吡啶甲酸3-hydroxypicolinicacid常用基质.基质简称中文名称英文名称激发波长SA芥子酸Sinapinic64MALDI-TOF-MS谱中的亚稳离子峰亚稳离子(metastableion)是指MALDI离子源产生的离子在无场飞行管道飞行时发生结构断裂，丢失中性分子后所产生的离子(子离子)。亚稳离子的特点是分辨率差，一般不能达到同位素分辨，而且只能在反射式的MALDI-TOF-MS谱中与其他离子区别出来。.MALDI-TOF-MS谱中的亚稳离子峰.65磷酸肽的亚稳离子峰β酪蛋白的胰蛋白酶酶解磷酸肽T48～63，质荷比为2061.8，发生β消除反应后脱去一个磷酸分子[M+H-H3PO4]+，质量数减少98，实际子离子质荷比应为1963.8，而其亚稳离子的表观质荷比为1969，比实际值大了5.2。.

66Harvey等推导了复杂的公式用于分析亚稳离子质荷比与其母离子、子离子质荷比之间的关系，公式如下：

HarveyDJ,HunterAP,BatemanRH,etal,InternationalJournalofMassSpectrometry,1999,188(1-2):131Ma：母离子质荷比Mb：子离子质荷比Mc：亚稳离子表观质荷比.Harvey等推导了复杂的公式用于分析亚稳离子质荷比与其母离67数据检索

借助专用生物信息学工具（例如SEQUEST和MASCOT等）和蛋白质序列数据库(例如IPI、NCBInr、SWISS-PROT等蛋白质数据库)，在一定的限制条件下，将质谱数据与蛋白质序列数据库中的相关信息进行比较和统计分析，给出肽段和相应的蛋白质列表，然后再根据一定置信水平的打分值实现对肽段和蛋白质的定性。.数据检索.68Combined(MS+MS/MS)Analysis–SampleSetupSpecifyAnalysisSettings–MSPeakFilteringOptimizedsettingscanbesavedasanewTemplatetomakefutureanalysesquickerandeasier

Trypsinautolyticpeaks,Keratinpeaks,internalstandards,etc.GPSExplorer™Software.Combined(MS+MS/MS)Analysis–69Combined(MS+MS/MS)Analysis–SampleSetupSpecifyAnalysisSettings–MS/MSPeakFilteringGPSExplorer™Software.Combined(MS+MS/MS)Analysis–70Combined(MS+MS/MS)Analysis–SampleSetupSavetheAnalysisSettings.Combined(MS+MS/MS)Analysis–71Combined(MS+MS/MS)Analysis–ResultsBrowserViewDatabaseResult.Combined(MS+MS/MS)Analysis–72Combined(MS+MS/MS)Analysis–ResultsBrowserViewDatabaseResult–ProteinSummaryReportProbabilitybasedMowsescoreandsignificanceoftophit.Combined(MS+MS/MS)Analysis–73Combined(MS+MS/MS)Analysis–ResultsBrowserViewDatabaseResult–ProteinSummaryReportDetailedresultsofmatchingpeptidesPeptidesshowinganIonScorewereselectedforMS/MS

Listofpeptidesnotmatchingthisprotein.Combined(MS+MS/MS)Analysis–74Combined(MS+MS/MS)Analysis–ResultsBrowserViewDatabaseResult–ProteinView

Sequenceandcoverage.Combined(MS+MS/MS)Analysis–75Combined(MS+MS/MS)Analysis–ResultsBrowserViewDatabaseResult–ProteinView

Peptidemasserrorinformation.Combined(MS+MS/MS)Analysis–76四、MALDITOF/TOFMS在蛋白质组研究中的应用1、在表达谱构建中的应用2DE-MALDI-TOF/TOFMS技术路线具有分离效率高、直观和相对定量的特点，被广泛应用于蛋白质组学的研究。目前该技术在我们实验室已经成功地应用于胎肝蛋白质组、血浆蛋白质组和成人肝脏蛋白质组等组织和细胞系蛋白质组的研究。.四、MALDITOF/TOFMS在蛋白质组研究中的应用77

2DE-MALDI-TOF/TOFMS技术平台技术路线特点：成功率(考染):大于90%

.2DE-MALDI-TOF/TOF78蛋白质组双向电泳zoom胶技术与MALDI-TOF/TOFMS联用为了获得更高的分离度，展示更多的蛋白质点，采用ZOOM胶技术是一个重要的选择，并通过MALDI-TOF/TOFMS的联用，可鉴定更多的蛋白质点。.蛋白质组双向电泳zoom胶技术与MALDI-TOF/TOF78.5

胎肝全蛋白2-DE表达谱共鉴定：601蛋白质，唯一蛋白质:330蛋白质.8.5胎肝全80将Fe3O4/ZrP纳米材料与样品溶液混合，在磁场作用将富集的磷酸肽分离出来，经溶剂洗脱之后进行质谱分析。

Fe3O4/ZrP磁性纳米材料富集磷酸肽的实验流程图2、在翻译后修饰研究中的应用（1）磷酸肽的Fe3O4/ZrP磁性纳米材料富集及MALDITOF/TOFMS分析.将Fe3O4/ZrP纳米材料与样品溶液混合，在磁场作用将富集81ab12

Fe3O4/ZrP纳米材料与不含ZrP基团的纳米材料的富集情况对比结果a应用Fe3O4/ZrP纳米材料的富集结果图；

b应用不含ZrP基团的纳米材料的富集结果图；c1pmol-Casein对照c12.12Fe3O4/ZrP纳米材料与不含ZrP基团的纳米材82c(2)1212abc

0.5pmol

-Casein与不同量BSA混合物经富集前后的质谱图a-Casein:BSA1:10对照b-Casein:BSA1:10富集后c-Casein:BSA1:20富集后.c(2)12120.5pmol-Ca83

1pmol

-Casein富集结果质谱图a：富集；b：不富集1234567891011a13671011b.1pmol-Casein富集结果质谱图12384Fe3O4/ZrP磁性纳米材料富集磷酸肽的性能标准磷酸肽标准磷酸肽114Label117Label富集不富集等体积混合串联质谱分析定量比较灵敏度50fmol的酪蛋白样品（1x10-9mol/L，50L）富集标准磷酸肽(FLpTEYVATR)样品时负载量为141.2pmol磷酸肽/mg纳米材料回收率约为53%.Fe3O4/ZrP磁性纳米材料富集磷酸肽的性能标准磷酸肽标85重复性表11pmol-Casein样品２０次重复实验的结果

.重复性表11pmol-Casein样品２０次重复实861pmolovalbumin经富集前后的质谱图上富集前；下富集后富集方法偏性考察TheoreticalpI3.91(m/z2088.91)5.32(m/z2511.13)5.38(m/z2901.32).1pmolovalbumin经富集前后的质谱图富集87bc121222a112在不同的Loadingbuffer中进行富集得到的质谱图a1pmol-Casein对照;bLoadingbuffer为50﹪ACN、0.1﹪TFA

cLoadingbuffer为50﹪ACN、0.1﹪TFA、100mMNaCl

.121222112在不同的Loadin88（2）

rhEPO中糖基化位点的鉴定

人促红细胞生成素（EPO）是一种糖蛋白，具有3个N-连接糖基化位点和1个O-连接糖基化位点，其最主要的功能是提高机体血红蛋白的浓度。

rhEPO的糖基化性质与其生物学功能及体内活性有非常密切的联系，因此进行各种糖基化性质的定性研究具有重要的意义。rhEPO有三个N-糖基化位点，分别是Asn-24，38和83，用PNGaseF切除糖链后，Asn变为Asp，质量数增加0.984，这样一种质量标签可以用于N-糖基化位点的鉴定；O-连接糖型分析则是基于酶切前后以及与理论值比较确定。.（2）rhEPO中糖基化位点的鉴定.89鉴定全部三个N-连接糖基化位点糖基化位点的质谱分析方法

N-连接糖型及0-连接糖型框架的比较分析.鉴定全部三个N-连接糖基化位点糖基化位点的质谱分析方法9038位N-连接糖基化位点鉴定.38位N-连接糖基化位点鉴定.91

O-连接糖型分析：PNGaseF和唾液酸酶两种酶联合使用与单用PNGaseF比较，前者切除N-连接糖链及O-连接糖链末端的唾液酸，后者只切除N-连接糖链，比较两种方法所得的图谱，并与理论值比对后，可以将测得的谱峰与糖型对应起来，从而可以进一步对不同产品的O-连接糖型的进行比较。PNGaseFPNGaseF+Sialidase.O-连接糖型分析：PNGaseF和唾液酸酶两种酶联923、在蛋白质相互作用研究中的应用

茶多酚EGCG与多肽亲核氨基酸残基相互作用研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EpigallocatechinGallate，EGCG)是茶叶中含量最多的活性成分之一，且多项研究表明EGCG是具有多种生物活性。实验研究表明，EGCG很可能是通过在体内与某些重要的功能蛋白质和关键多肽因子（如：GSH、酶等）发生共价相互作用，使得这些蛋白的功能发生了变化，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。我们主要研究了除GSH外，其他含巯基的肽段与EGCG的反应，以及在pH7.4的生理条件下，EGCG与多肽精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和N－端伯氨基的共价结合反应特性。首先考察了不同氨基酸组成对EGCG与多肽中半胱氨酸相互作用的影响.3、在蛋白质相互作用研究中的应用.93实验步骤（1）分别合成了分别含有两个半胱氨酸、且其他氨基酸序列不同的两个标准模型肽段P1、P2(P1:SGGDILQSGCCG，M.W.=1095.5Da;P2：WGLGGTCVNVGCIPK,M.W.=1502.9Da)；

（2）分别制备EGCG与P1、P2反应的样品溶液和相应的对照品溶液。反应完成后，分别脱盐，点靶，进行MALDI－TOF－MS的质谱分析。.实验步骤.94A：P1肽段的对照以及质谱图；B：P1与EGCG共孵育后的一级质谱图.A：P1肽段的对照以及质谱图；.95与对照组质谱图（图A）相比较，在样品组的质谱图中（图B），发现了两个新的质谱峰：质荷比分别为m/z1552（（P1＋EGCG＋H）＋）和m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋），而在对照组中，没有发现此两个质谱峰。经计算，这两个新的质谱峰的质量数正好与P1肽段分别和1个EGCG醌（M.W.=456Da）和2个EGCG醌（2×456Da）发生加成反应所得加成产物的质量数一致。而这两个新的质谱峰在P1肽对照一级质谱图中并没有出现，此现象表明，将EGCG与P1肽段混合后，有新的反应产物生成。另外，P1肽经与EGCG共孵育后，P1肽的m/z值由对照中的1096变成孵育后的1094，此现象表明，P1肽的两个自由巯基很可能形成了二硫键，从而造成质量数减2Da的结果。为了进一步确证上述的推测以及确证EGCG的具体反应位点，我们分别选择m/z1552和m/z2008作为母离子进行二级质谱扫描。.与对照组质谱图（图A）相比较，在样品组的质谱图中（图96A：P1肽的二级质谱图；B：m/z1552（（P1＋EGCG＋H）＋）的二级质谱图.A：P1肽的二级质谱图；.97经过与P1肽段的二级谱图的比较分析，我们发现，两图中的b4+～b9+是完全一样的，表明m/z1552（（P1＋EGCG＋H）＋）的b9+之前的氨基酸序列与P1一致，且没有被EGCG共价结合；而图B中的b11+离子m/z1477与图Ab11+离子m/z1021相差456，456正好是EGCG醌式结构的质量数，所以可以肯定EGCG是结合在了P1肽的b9到b11之间，即结合到P1肽的其中一个半胱氨酸上。

同理，图B中的y6+、y7+离子与图A的y6+、y7+离子均相差456，这也能证明EGCG的存在。.经过与P1肽段的二级谱图的比较分析，我们发现，两图中98A：P1肽的二级质谱图；B：m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋）的二级质谱图

.A：P1肽的二级质谱图；.99对于m/z2008的母离子，图A为P1肽段的二级质谱图，图B为m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋）的二级质谱图，经过与P1肽段的二级谱图的比较分析，我们发现，两图中的b4+～b9+是完全一样的，表明m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋）的b9+之前的氨基酸序列与P1一致，且没有被EGCG共价结合；而图B中的b10+离子m/z1374与图Ab10+离子m/z918相差456，456正好是EGCG醌式结构的质量数，所以可以肯定，m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋）的b10+离子的半胱氨酸上结合了一个EGCG；而图B中的b11+离子m/z1933与图3b11+离子m/z1021相差912，即2个456，表明m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋）的b10+、b11+离子的半胱氨酸上分别结合了一个EGCG，即一共结合了两个EGCG分子；同样，图B中的y6+、y7+离子与图A的y6+、y7+离子均相差912，这也能证明2个EGCG的存在。.对于m/z2008的母离子，图A为P1肽段的二级质谱图，图100基于以上类似的思路，我们应用高灵敏度的基质辅助激光解析－飞行时间－质谱(MALDI-TOF-MS)系统地研究了EGCG分别与甲硫氨酸残基、N端伯氨基、精氨酸残基、半胱氨酸残基等，在生理pH7.4的缓冲溶液中，37℃孵育后，所发生的共价结合反应的特性，为深入研究EGCG在体内的抗肿瘤作用机理提供新的证据，且为进一步研究EGCG与其他具有重要功能的蛋白的相互作用提供更多的信息和研究手段。.基于以上类似的思路，我们应用高灵敏度的基质辅助激光解1014、在蛋白质相对和绝对定量研究中的应用

iTRQA试剂结合MALDITOF/TOFMS用于蛋白质（组）的相对定量方法.4、在蛋白质相对和绝对定量研究中的应用.102基本原理（1）试剂的反应基团（PRG）特异地与肽段的N-端氨基和Lys的ε-氨基结合；（2）平衡基团与不同质量的报告基团在一级质谱图上显示为一个峰，为肽段质量数加上144Da；(3)在二级质谱图上，报告基团特异性地断裂，其比值即为两样本中蛋白的相对定量。.基本原理.103IsobaricTagging-GeneralMethod(4-Plex)PEPTIDE

PEPTIDEPEPTIDE++++PEPTIDE-PRG11431-PRG11530-PRG11629-PRG117281347.01349.61352.21354.81357.41360.0Mass(m/z)1352.84Reporter-Balance-PeptideINTACT-4samplesidenticalm/zMS114115116117111.0112.8114.6116.4118.2120.0Mass(m/z)114116115117-ReporterionsDIFFERENTMix-NHPEP

T

ID

E11431-NHPEP

T

ID

E11530-NHPEP

T

ID

E11629-NHPEP

T

ID

E11728MS/MS9.0292.8576.6860.41144.21428.0Mass(m/z)8396.70102030405060708090100%Intensityy8PAb2y10q,H72.1b4b145.1b7LT112.1y3b10y5b9y2b674.11352.8y6142.139.0y4b8y9y11-PeptidefragmentsEQUALPEPTIDE.IsobaricTagging-GeneralMet104标记前和标记后BSA酶切肽段质谱图.标记前和标记后BSA酶切肽段质谱图.105

iTRAQ标记BSA胰酶酶切肽段（1071.61）的MS/MS检测.iTRAQ标记BSA胰酶酶切肽段（1071.61）的MS/106SummedIonIntensity(~75,000Spectra)ReporterGroupPlacement:

Selectionof‘QuietRegion’.SummedIonIntensity(~75,000107样品1混合Trypsin酶切LC-MS/MSiTRAQ标记（114）变性剂、还原剂、Cys封闭剂温育样品2Trypsin酶切iTRAQ标记（115）实验流程及试剂结构

变性剂、还原剂、Cys封闭剂温育.样品1混合Trypsin酶切LC-MS/MSiTRAQ标108MS/MS质谱峰过滤条件.MS/MS质谱峰过滤条件.109DatabaseSearch和PerformQuantitation条件定量条件设置.DatabaseSearch和PerformQuant110考察因素（1）标记完全程度；（2）动态范围(30倍，相对误差<30%)；(3)灵敏度（4）色谱行为，同位素效应不显著；（5）质谱行为，主要为b和y离子序列。

通过实验的考察和优化，建立了iTRAQ标记试剂结合MALDITOF-TOFMS的蛋白组相对定量方法。应用：该方法已经用于脂肪肝大鼠肝组织蛋白质组研究注意事项：（1）不能引入带有伯氨基的试剂（还原剂：TCEP；半胱氨酸残基封闭剂：MMTS（硫甲磺酸S-甲酯））；（2）标记过程中水相比例：小于30％；（3）体系不能肽复杂，即对于复杂生物样本需要预分离步骤。.考察因素.111谢谢！.谢谢！.112MALDITOF/TOFMS在蛋白质组研究中的应用

张养军军事医学科学院反射与辐射医学研究所北京蛋白质组研究中心2009年4月.MALDITOF/TOFMS.113报告内容：一、蛋白质组学简介二、生物质谱用于蛋白质组鉴定的基本原理三、MALDITOF/TOFMS仪器组成和基本原理四、MALDITOF/TOFMS在蛋白质组研究中的应用1、在表达谱构建中的应用2、在翻译后修饰研究中的应用3、在蛋白质相互作用研究中的应用4、在蛋白质相对和绝对定量研究中的应用.报告内容：.114一、蛋白质组学简介蛋白质组（proteome）：一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质。蛋白质组学（proteomics)：研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成、定位、变化及其相互作用规律的科学。简要历史回顾：1994年，澳大利亚的科学家首次提出蛋白质组概念；1995年，蛋白质组一词首次见诸报端；2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织(HumanProteomeOrganization,HUPO)，随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，期望共同努力，完成人类蛋白质组计划(HumanProteomeProject)；另外，创刊了蛋白质组学专门杂志，如《Proteomics》、《Molecular&cellularproteomics》和《Journalofproteomeresearch》；2002年～现在，已举行了六届HUPO国际会议和五届中国蛋白质组学术大会。.一、蛋白质组学简介.115蛋白质组研究的意义1、一些物种如小鼠、大鼠等基因组测序工作的完成，特别是人类基因组计划草图完成（2001年）后，人们面临的迫切任务之一便是对基因组的功能注释，而在基因组和转录组水平上常常无法回答许多生物学问题，如基因转录和翻译的起始位点、翻译后修饰种类和位点、定位信息以及相互作用等问题，因此，蛋白质组的研究是基因组研究的深入和延续；2、作为生命功能的执行体——蛋白质组的研究是为了从更高层次上深入解读生命的本质和生命活动的规律。3、通过人类疾病蛋白质组的研究，为病理研究、早期诊断、治疗以及药物开发提供依据。.蛋白质组研究的意义.116蛋白质组学研究的内容1、蛋白质组表达谱(proteomeexpressionprofiling)针对已有基因组或转录组数据库的生物体、组织或细胞，建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库。2、蛋白质组修饰谱(proteomemodificationprofiling)构建蛋白质翻译后修饰的种类、修饰位点以及修饰官能团的结构等数据库。3、基本生物学问题研究与生命活动过程中密切相关的问题。比如：蛋白质组成和空间结构、定位和相互作用网络等；.蛋白质组学研究的内容.1174、临床应用问题以重要的生理过程或人类一些重大疾病为对象，进行重要的生理和病理体系或过程的研究，即进行比较蛋白质组学研究，包括疾病发生和发展机制、疾病诊断标志物以及药物靶标等；

5、蛋白质组学中的新技术和新方法建立蛋白质组学研究的支撑技术平台以及生物信息学研究工具，包括各种定性、定量、结构分析和生物信息学软件和数据库。.4、临床应用问题.118

蛋白质组研究中的复杂性一种细胞、组织或生物体有多少蛋白质?人类基因组含有3～4万个基因，与小鼠的基因数相差不多，仅是果蝇或线虫的两倍左右，但他们的表型相差却如此巨大，其根本问题便是蛋白质组的差异所致。30000-40000个基因30000个基因共享99%基因.蛋白质组研究中的复杂性30000-40000个基因3119PosttranslatedmodificationInteractionConformationtransformationPosttranslatedsplicingDisplacementcytoplastnuclei蛋白质多样性一个基因表达多少种蛋白质？.PosttranslatedInteractionCon120

对于人体：

1个受精卵发育成1012细胞，103细胞类型。其“蛋白质组”随“时”、“空”处于变化之中，而“基因组”则相对处于不变之中。因此，我们可以得出：生命体的统一性源于基因组，生命体的复杂性源于蛋白质组。.对于人体：.121主要研究策略1、研究基础（1）生物学的发展，特别是越来越多生物基因组测序的完成，为我们提供了蛋白质组数据库；（2）生物质谱和分离科学的进步为我们提供了分离和鉴定的技术平台和必须的手段；（3）计算机技术的提高，特别是生物信息学的发展为我们处理海量数据提供了有力的支持和保障。.主要研究策略.1222、蛋白质组学研究方法分类（1）蛋白质组定性分析

依据分析对象是整体蛋白质混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白质组的定性分析方法分为自下向上法（bottomup）和自上向下法(topdown)；依据蛋白质的序列特征，蛋白质组定性分析方法可分为：肽质量指纹谱法（PMF)和肽序列标签法（PST,也叫denovo法）

.2、蛋白质组学研究方法分类.123（2）蛋白质组定量分析方法①直接进行比较，包括SDS、2DE、HPLC；②标记方法，包括同位素标记亲和标签（ICAT，iTRQA）、元素标记亲和标签（ECAT）、酶促18O标记、DYGE技术和同位素氨基酸细胞培养标记(SILAC)。.（2）蛋白质组定量分析方法.1243蛋白质组研究方法进展(1)复杂蛋白质组体系

目前对于组织、细胞和血浆等复杂蛋白质组的分析，均采用多维分离技术与质谱联用的方法。其技术路线如图1和图2所示。.3蛋白质组研究方法进展.125细胞、组织或体液蛋白质提取液整体蛋白质混合物预分离包括：2DE，2DLC，或LC-SDS等不同馏分或蛋白质电泳带多肽混合物溶液酶切或胶上原位酶切PMF，PSTORDENOVO数据蛋白质组MALDIMSorMSMSorcLC-ESI-MSMS

生物信息学工具图1整体蛋白质组预分离分析技术路线超声、离心处理或亚细胞器分级.细胞、组织或体液蛋白质提取液整体蛋白质混合物预分离包括：不同126细胞、组织或体液蛋白质提取液多肽混合物PSTORDENOVO数据蛋白质组MALDIMSMSorc2DLC-ESI-MSMS

生物信息学工具

图2多维蛋白质组分析技术（鸟枪法蛋白质组学方法）

超声、离心处理或亚细胞器分级溶液酶切.细胞、组织或体液蛋白质提取液多肽混合物PSTORDEN127BenjaminF.Cravatt,GabrielM.Simon&JohnR.YatesIII,Thebiologicalimpactofmass-spectrometry-basedproteomics.NATURE,Vol450:991-1000(2007)A.J.Link,J.EngD.M.Schieltz,E.Carmack,G.Mize,D.R.Morris,B.M.Garvik,J.R.Yates,III,Directanalysisofproteincomplexesusingmassspectrometry,NatureBiotechnology17,676-682(1999)

（JohnR.YatesIII，TheScrippsResearchInstitute

）鸟枪法蛋白质组学方法可形象图示为:.BenjaminF.Cravatt,GabrielM128(2)简单的蛋白质组体系对于特定的、简单的蛋白质组分析，既可采用多维分离技术与质谱联用的方法，也可以采用较少步骤的分离和质谱联用技术。其技术路线如图3所示。.(2)简单的蛋白质组体系.129细胞或组织蛋白质提取液整体蛋白质混合物分离SDS，IEF，HPLC不同馏分或蛋白质电泳带多肽混合物溶液酶切胶上原位酶切PMF，PSTORDENOVO数据蛋白质组MALDIMSMS,cLC-ESI-MSMS

生物信息学工具图3特定或目标蛋白质组分离分析技术超声、离心处理或亚细胞器分级.细胞或组织蛋白质提取液整体蛋白质混合物分离不同馏分或蛋白质电130(3)数据标准为确保蛋白质组数据的可靠性，以《Molecular&CellularProteomics》为代表的蛋白质组学专业杂志对蛋白质组数据产出、处理、质量控制和发表提出了严格的要求，具体包括：实验方法、数据处理程序名称和版本、蛋白质数据库和版本、数据判断的阈值和统计方法、蛋白质的名称、序号和覆盖率、肽段的序列和分值等。另外，数据可靠性评价标准：如概率法、反转数据库法等评价方法已获得广泛应用。.(3)数据标准.131(4)、蛋白质组技术方法发展趋势蛋白质组研究中目前面临的技术挑战主要是：标准化方法的验证以及数据的精确性和重现性、简便有效的验证技术和定量技术。就技术本身而言仍然是分析化学的基本问题即选择性、准确性、灵敏性、重现性、可行性和动态范围。具体包括：1、标准化、高灵敏度和高重现性的微量蛋白质组学分析方法的建立及验证和评价体系；2、“鸟枪”蛋白质组学方法向“导弹”蛋白质组学发展，即基于中心法则和转录组数据，直接鉴定相关蛋白质组，而不是随机鉴定蛋白质组；.(4)、蛋白质组技术方法发展趋势.132