中药致癌作用

第七章中药致癌作用ChemicalCarcinogenesis癌症是遗传因素和环境因素交互作用的结果1775年英国Pott报告扫烟囱工人阴囊癌高发，提出与煤烟尘有关；1895年德国Rehn报告染料工人职业性膀胱癌，疑是化学物质引起；1915年日本山极和市川用煤焦油成功诱发实验性皮肤癌；1922年英国Kennway从煤焦油中分离出多种多环芳烃，其中几种可诱发动物皮肤癌，证实了化学物的致癌性；1945年英国Caes对染料工业膀胱癌流行病学调查，证实β–萘胺及联苯胺的致癌性。1970年，国际癌症研究所：80~90%的人类癌症和环境因素有关，其中主要是化学因素，约占90%以上。化学致癌作用(chemicalcarcinogenesis指化学物质引起并诱导正常细胞发生恶性转化并发展成为肿瘤的过程。化学致癌物(chemicalcarcinogen)具有致癌作用的化学物质。前致癌物(pro-carcinogen)间接致癌物(indirect-carcinogen)近致癌物(proximatecarcinogen)终致癌物(ultimatecarcinogen第一节化学致癌过程正常细胞经过遗传学改变的积累，才能转变为癌细胞，癌症的发生是多阶段过程，包括：引发阶段(initiation)促长阶段(promotion)进展阶段(progression)一、引发阶段概念：化学物或其活性代谢物与DNA作用，导致体细胞突变的过程。引发剂(initiator)：大多数是致突变物，没有可检测的阈剂量。引发作用靶点：原癌基因和肿瘤抑制基因引发细胞(initiatedcell)引发时间短，是一个突变事件，需经过细胞分裂来“固定”引发是不可逆遗传性改变，表型可能正常，无自主生长性----非肿瘤细胞并非所有引发细胞均将形成肿瘤，大多数细胞将凋亡。二、促长阶段概念：引发细胞增殖成为癌前病变或良性肿瘤的过程。促长剂(promoter)：具有促长作用的化学物。促长剂性质：非突变剂，有量效关系、阈剂量和最大作用。通常能引起局部增殖并引起良性肿瘤，少数细胞可成恶性肿瘤。促长阶段特点：时间长，早期可逆，晚期不可逆。对生理因素调节敏感(特别是早期)，衰老、激素和饮食可影响促长作用。对开展肿瘤预防有重要意义促长作用机制复杂，可通过改变基因表达起作用。促长剂：佛波酯(TPA，巴豆油活性成分)—小鼠皮肤癌糖精----膀胱癌四氯二苯并对二恶英(TCDD)---大鼠肝癌、肺、皮肤肿瘤性激素—作用器官、肝脏肿瘤

证实引发和促长作用实验：

周期：3-6个月终点：癌前损害(PNL)--小鼠皮肤乳头瘤、大鼠和小鼠肝转化灶等三、进展阶段概念：从癌前病变或良性肿瘤转变成恶性肿瘤的过程恶性生物学特征：自主性和异质性增加、生长加速、侵袭性加强、出现浸润和转移。出现恶性特征原因：--核型不稳定性(染色体不稳定性)：染色体发生断裂、断片易位及非整倍体变化。微卫星不稳定性(micosatelliteinstability，MSI)--不稳定性生物学标志：进展剂(progressor)：使细胞由促长阶段进入进展期的化学物。--砷酸盐、石棉纤维、苯、羟基脲等完全致癌物(compelet

carcinogen)同时具有引发、促长及进展阶段作用的致癌物。(黄曲毒素)综上所述----化学物致癌是是长期的、复复杂的多阶段段过程，至少少涉及引发、、促长和进展展三个阶段。。在引发和进展展阶段主要是是遗传机制，，在促长阶段段主要是表遗遗传机制。在在引发阶段主主要是细胞原原癌基因和肿肿瘤抑制基因因的突变，在在进展阶段主主要是核型不不稳定。正常细胞经过过遗传学改变变的积累才转转变为癌细胞胞。遗传机制学说说(genetictheory)：外来致癌因素素引起细胞基基因的改变或或外来基因整整合到细胞基基因中，导致致癌变。表遗传机制学学说(epigenetictheory)：癌症的发生是是由于非基因因改变机制引引起的化学致癌机制制学说：亲电子剂学学说、体细胞胞突变学说、、癌基因学说说、癌变多阶阶段学说第二节化学学致癌机制体细胞突变学学说突变与癌症：：1)很多致癌癌物是致突变变物2)对某些致致癌物的易感感性取决于细细胞代谢活化化酶转化致癌癌物成为致突突变物的活力力3)DNA修修复能力的缺缺失增加癌发发生的可能性性4)在多种癌癌观察到染色色体和基因组组的不稳定性性5)某些癌有有突变的癌基基因6)癌的单克克隆性7)某些癌具具有可遗传性性8)某些癌有有肿瘤抑制基基因的丢失或或突变癌基因与肿瘤瘤抑制基因癌基因(oncogene)：一类能引起起细胞恶性转转化及癌变的的基因。通常常以原癌基因因(pro-oncogene)形形式普遍存在在于正常基因因组内。在进进化过程中高高度保守，具具有正常的生生物学功能，，对细胞增殖殖、分化和信信息传递的调调控起重要作作用。只有当当受到各种致致癌因素作用用而激活变为活化的癌癌基因或过度表达后才显示其致致癌性。如ras基因家族肿瘤抑制基因因(tumorsuppressorgene)：抑癌癌基因或抗癌癌基因。作用用方式与癌基基因相反，在在正常细胞中中抑制增殖和和促进分化。。在致癌因素素作用下，肿肿瘤抑制基因因突变或失活而引起细胞的的恶性转化。。如p53非突变致癌机机制化学物通过不不涉及基因结结构(DNA序列)的改改变，使基因因外的一些变变化，影响基基因的调控，，使基因出现现不正常关闭闭和开放，进进而影响细胞胞的增殖，引引癌变。表遗传学(epigenetics)研究从从基因演绎为为表型的过程程和机制的一一门遗传学分分支学科。(在基因的DNA序列列没有发生改改变的情况下下,基因功能能发生了可遗遗传的变化,并最终导致致了表型的变变化。)1、表观遗传传调控失常导导致肿瘤发生生2、细细胞异异常增增生3、免免疫抑抑制4、内内分泌泌激素素失衡衡5、过过氧化化酶体体增殖殖剂激激活受受体第三节节、化化学致致癌物物分类类(作作用机机制)遗传毒毒性致致癌物物(genotoxiccarcinogens)非遗传传毒性性致癌癌物(non-genotoxiccarcinogens)表(观观)遗遗传致致癌物物(epigeneticcarcinogens)1、遗遗传性性致癌癌物概念：：进入细细胞后后作用用于遗遗传物物质(主要要是DNA)，，通过过引起起细胞胞遗传传物质质的改改变，，导致致癌变变的化化学物物---可利利用遗遗传毒毒理学学试验验来检检测(1)直接接致癌癌物(directcarcinogen)：无无需体体内代代谢活活化即即可致致癌。。大多数数为亲亲电子子剂，，可与与细胞胞大分分子亲亲核中中心发发生共共价结结合。。如：烷烷基和和芳香香基环环氧化化物、、内酯酯、硫硫酸酯酯、亚亚硝酰酰胺等等(2)、间接致致癌物物(indirectcarcinogen)：：需体体内代代谢，，活化化代谢谢产物物致癌癌。前致癌癌物(precarcinogen)近致癌癌物(proximatecarcinogen)：：代谢谢后先先转变变为化化学性性质活活泼但但寿命命短暂暂的中中间形形式终致癌癌物(ultimatecarcinogen产物为为亲电电子剂剂，一些可可能有有多种种代谢谢产物物如：多多环芳芳烃类类化合合物、、芳香香胺类类、亚亚硝胺胺类、、偶氮氮化合合物、、硝基基杂环环类、、黄曲曲毒素素B1等(3)、无无机致致癌物物：有些可可能是是亲电电子剂剂，但但可通通过选选择性性改变变DNA复复制保保真性性，导导致DNA改变变如：金金属镍镍、铬铬、钛钛、镉镉或它它们的的盐类类等有些无无机元元素由由于放放射性性致癌癌如：氡氡、铀铀、钋钋、镭镭等2、非非遗传传性致致癌物物概念：：不作用用于机机体遗遗传物物质的的化学学致癌癌物可能间间接影影响DNA并改改变基基因组组导致致细胞胞癌变变，通通过促促进有有丝分分裂和和抑制制凋亡亡导致致癌的的发展展。(1)、、促长剂剂：本身无致致癌性在给以遗遗传毒性性致癌物物之后再再给予促促长剂可可增强遗遗传毒性性致癌物物的致癌癌作用；；可促进““自发性性”转化化细胞发发展成癌癌。如：佛波波酯(TPA及及其衍生生物)——小鼠皮皮肤癌(已知活活性最高高)色氨酸、、糖精----膀胱癌癌二恶英(TCDD)、、DDT、氯丹丹、苯巴巴比妥---肝肝癌丁基羟甲甲苯(BHT)—肺肿肿瘤、肝肝细胞腺腺瘤、膀膀胱癌(2)、、激素调调控(内分泌调调控)：主要要改变内内分泌系系统平衡衡及细胞胞正常分分化，常常起促长长剂作用用如：雌、、雄激素素、类固固醇雌二醇、、已烯雌雌酚---人、、动物肿肿瘤已烯雌酚酚---经胎盘盘致癌与化学致致癌物同同时或稍稍后接触触睾酮或或合成激激素---前列列腺癌或或其他性性器官肿肿瘤抑制甲状状腺激素素合成或或分泌物物质—甲甲状腺瘤瘤长期在剂剂量使用用抗甲状状腺物质质如硫脲脲、某些些磺胺类类药物---肿肿瘤(3)、、细胞毒毒剂：可引起起细胞死死亡，导导致细胞胞增殖活活跃及癌癌发展如：氮川川三乙酸酸---大鼠肾肾癌、膀膀胱癌氯仿等(4)、、过氧化化物酶体体增殖剂剂：导致细细胞内氧氧自由基基过量生生成过氧化物物酶体增增殖剂(peroxisomeproliferator)：可引引起肝脏脏过氧化化物酶体体增殖的的化合物物。如：降血血脂药：：氯贝丁丁酯(安安妥明)增塑剂：：邻苯二二甲酸乙乙基已酯酯(5)、、免疫抑抑制剂：主要对对病毒诱诱导的恶恶化转化化起增强强作用如：嘌呤呤同类物物(咪唑唑嘌呤、、巯嘌呤呤)—人人或动物物白血病病或淋巴巴瘤(6)、、固态物物质：物理状状态是关关键性因因素如：一些些惰性物物质(塑塑料)或或金属薄薄片---啮齿齿类动物物体内的的种植部部位引发发肉瘤(物理特性性、表面面积决定定致癌能能力)石棉纤维维—恶性性间皮瘤瘤或呼吸吸系统肿肿瘤(石石棉的晶晶体结构构，与组组分无关关)3、未分分类如：二噁噁烷、美美舍吡伦伦、乙醇醇、丙烯烯腈等助癌物Cocarcinogen：：本身或单单独接触触无致癌癌性，在在致癌物物之前或或同时接接触可增增加肿瘤瘤的发生生的一类类化合物物。本身既不不具引发发作用，，也不具具促长作作用，但但可促进进引发作作用和增增强促长长作用，，即促进进或增强强全部致致癌过程程如：芘：：苯并(a)芘芘---皮肤肿肿瘤香烟雾中中儿茶酚酚、其他他酚类---促促长剂、、助癌物物第四节中中药致致癌物的的评定主要根据据：人群流行行病学调调查：可信度取取决于严严密的设设计，研究过程程受许多多因素限限制和干干扰动物试验验结果：：花费大，，周期长长，动物使用用数量大大一般评定定分析流流程：化学物构效关关系分析：利用定量构效效关系(QSAR)，从从有害物质的的化学结构特特点来评估受受试物潜在的的致癌危险性性短期试验：致突变组合试试验、细胞恶恶性转化试验验、哺乳动物短期期致癌试验等等进行初步筛查查，若结果阳阳性再进行下下一步试验哺乳动物长期期致癌试验：：经典、标准致致癌性检测方方法一、短期试验验(一)致突变变试验优点：方法简单、快快速、费用低低、无需特殊殊检测仪器缺点：需要组合试验验，无法检出出非遗传毒性性致癌物(阳性：遗传传毒性致癌物物or遗传毒毒性非致癌物物阴性：非遗传传毒性非致癌癌物or非遗遗传毒性致癌癌物)要求：灵敏度(sensitivity)--阳性符符合率(呈阳阳性的比例)特异性(specificity)--阴性符符合率(呈阴阴性的比例)①基因突变试试验：鼠伤寒沙门菌菌回复突变试试验(Ames试验)、、培养哺乳动动物细胞TK或HGPRT正向突变变试验；②染色体畸变变试验：体外细胞系细细胞遗传学试试验、小鼠骨骨髓微核试验验、大鼠骨髓髓染色体畸变变试验；③原发性DNA损伤：DNA加合物物、链断裂、、慧星试验、、DNA修复复诱导(细菌菌SOS反应应，大鼠肝UDS诱导)、SCE试试验；④体外细胞转转化：叙利亚地鼠胚胚胎细胞(二)细胞恶恶性转化试验验

(cellmalignanttransformationassay)概论：外源因素对体体外培养的细细胞所诱发的的恶性表型改改变，包括细细胞形态、细细胞增殖速度度、生长特性性、软体畸变变等变化，当当细胞接种在在裸鼠皮下可可形成肉眼可可见的肿瘤。。即培养细胞在在有害因素作作用下发生一一系列与肿瘤瘤形成有关的的细胞形态学学及生物学特特性的改变。。体外细胞转化化是一个多阶阶段的过程，，具有体内致致癌过程的某某些特点，最最终产生在形形态学、生长长方式、生物物化学上发生生改变的细胞胞克隆。例：成纤维细细胞体外转化化的表型改变变：在等基因宿主主或裸鼠体内内形成肿瘤；细胞估计寿命命无限长(永永生化)；核型改变；细胞形态改变变；生长杂乱；失去锚基依赖赖性生长特性性，可在软琼琼脂中形成集集落；能在低血清培培养液生长；；丢失某些表面面蛋白；具有纤维蛋白白溶解活性；；表面微绒毛增增加；-------------观察终点：细胞恶变(遗传学终点之之一)确定恶性转化化的可靠指标标：在敏感宿主中中的成瘤性。。通常是接种种于免疫抑制制动物半固体培养基基中成杂乱生生长、形成集集落及细胞交交叉重叠常用细胞株(系)：金黄地鼠胚胎胎细胞(GHE)、叙利利亚地鼠胚胎胎细胞(SHE)、中国国地鼠肺细胞胞(CHL，，V79)、、BALB∕C-3T3发展趋势：动物原代细胞胞培养系统(SHE)非整倍体细胞胞系人体上皮细胞胞(人类癌症症70%源于于此)细胞选择的主主要原则：①体外容易培培养和传代，，阴性细胞克克隆背景较低低；②细胞自发突突变率低或自自发转化能力力很弱，动物物裸鼠试验呈呈阴性；③已获无限生生长能力，但但仍保持接触触抑制而无致致瘤性的细胞胞系(如病毒毒感染的永生生化细胞：大大鼠RLV∕∕RE细胞胞和仓鼠SA7∕SHE细胞)；细胞恶性转化化试验评价：1、体外转化化试验的终点点仍属形态转转化或恶性前前期转化。此此种转化可能能发展为真正正肿瘤，也可可能停滞在此此阶段，不进进一步恶化。。因此阳性结果果的解释应慎慎重，仅提示示受试物有致致癌可能性。2、观察终点点是细胞恶变变，因此既可可筛查遗传毒毒性毒物，也也可检测非遗遗传毒性毒物物。3、体外试验验不能代替体体内试验。4、通常测试试细胞中代谢谢酶活性低下下，降低了系系统对间接致癌癌物的检测敏敏感性。。(三)哺哺乳动物物短期致致癌试验验有限体内内致癌试试验(limitedcarcinogenicitytest)有限动物物试验(limitedinvivobioassay)时间有限限(数月月)，靶靶器官有有限原理：某些受试试物对某某些特定定组织的的致瘤作作用，比比其它组组织更为为明显。。(观察特特点靶器器官的肿肿瘤发生生情况)观察终点点：不是病理理确认的的恶性肿肿瘤，而而是以癌癌前病变变如腺瘤瘤、瘤性性增生结结节为主主(周期短短)常用试验验：1、小鼠鼠皮肤肿肿瘤诱发发试验小鼠连续续涂抹受受试物，，以观察察皮肤乳乳头瘤和和癌的发发生，一一般20周。敏敏感小鼠鼠为SENCAR小鼠鼠。可用于检检测引发发活性(多环芳芳烃)或或促长活活性(TPA(佛波醇醇酯))2、小鼠鼠肺瘤诱诱发试验验染毒途径径常用腹腹腔注射射，也可可灌胃或或吸入，，一般30周，，观察肺肺肿瘤的的发生。。敏感小小鼠为A系小鼠鼠。可用于检检测引发发活性(乌拉坦坦)或促促长活性性(BHT(二二丁基羟羟基甲苯苯))3、大鼠鼠肝转化化灶诱发发试验大鼠肝进进行大部部分切除除后，给给予受试试物。一一般8~14周周，观察察肝转化化灶生成成。肝转转化灶是是癌前病病变，有有γ-谷氨氨酰胺转转肽酶(γ-GT)活活性升高高，G6P酶和和ATP酶活性性降低，，以及摄摄铁能能力下降降。典型型引发剂剂为二乙乙基亚硝硝胺(DEN)。转化化灶可用用组织化化学或免免疫化学学方法鉴鉴定。可用于检检测引发发活性(二乙基基亚硝胺胺DEN)或促促长活性性(苯巴巴比妥PB)4、雌性性大鼠乳乳腺癌诱诱发试验验一般可用用SD大大鼠(或或Wistar)，周周期6个个月。方法学评评价：1、此四四个试验验不是成成组试验验，应根根据受试试物特点点选择使使用；2、阳性性结果与与长期动动物致癌癌试验相相似；3、由于于仅观察察特定器器官，试试验周期期短，阴阴性结果果不能排排除受试试物致癌癌性；4、肝和和肺是最最常发生生肿瘤的的器官，，也是众众多致癌癌物的靶靶器官，，所以多多数试验验选用小小鼠肺肿肿瘤诱发发试验和和大鼠肝肝转化灶灶试验。。(四)转转基因动动物致癌癌检测模模型优点：研究致癌癌过程特特定基因因的作用用；快速速检测方法：1、转癌癌基因小小鼠：提提高动物物对化学学致癌物物的敏感感度2、肿瘤瘤抑制基基因敲除除小鼠：：评价：：标准化化等不不完善善二、哺哺乳动动物致致癌试试验(long-termcarcinogenicitystudy)鉴定化化学致致癌物物的标标准体体内试试验试验目目的：：确定受受试物物对试试验动动物的的致癌癌性、、剂量量-反反应关关系及及诱发发肿瘤瘤的靶靶器官官需要进进行致致癌试试验的的一般般原则则：1、人人体可可能长长期暴暴露于于该化化学物物2、该该化学学物或或其代代谢产产物的的化学学结构构与已已知致致癌物物相似似3、反反复染染毒毒毒性试试验提提示该该化学学物可可能产产生癌癌前病病变ICH：需需进行行致癌癌性试试验的的新药药1、持持续用用药6个月月以上上的药药品2、过过去的的数据据显示示此类类别的的药品品可能能致癌癌3、药药品的的作用用机制制推测测可能能有致致癌性性者4、重重复剂剂量毒毒性的的试验验结果果显示示有肿肿瘤生生成现现象的的药品品5、药药品的的成分分或其其代谢谢产物物长期期停留留在组组织中中，产产生局局部的的组织织作用用或病病理生生理反反应6、基基因毒毒性试试验结结果显显示有有致突突变性性等拟用于于病人人预期期寿命命少于于3年年的药药品不不必进进行致致癌试试验，，如肿肿瘤治治疗药药；若若药物物或制制剂只只针对对有限限的特特定疾疾病或或患者者进行行治疗疗，疗疗效确确切、、稳定定时，，可视视在药药物获获准上上市后后的需需要进进行致致癌试试验ICH：致致癌试试验基基本原原则(新药药)基本程程序：：一个长长期啮啮齿类类致癌癌试验验，另另一个个进一一步的的体内内试验验(补补充长长期试试验不不易得得到的的信息息)1、选选择合合适的的物种种根据据：药药理、、代谢谢、毒毒理、、毒物物动力力学、、给药药途径径等。。缺乏明明显优优先证证据时时，推推荐选选择大大鼠短期、、长期期、遗遗传或或其它它资料料表明明对人人致癌癌，通通常不不进行行第二二个试试验2、进一步步的致癌性性体内试验验(1)短期期或中期体体内啮齿类类试验系统统：引发-促长模型型，如大鼠鼠肝转化灶灶促长试验验，多器官官促长试验验(用5种种引发剂后后再染毒性性数月)；；转基因小小鼠试验；；新生啮齿齿类致癌模模型。(2)第二二种啮齿类类长期致癌癌试验3、选择中中、短期致致癌试验的的考虑：试试验方案的的合理性、、方案的优优缺点和分分析4、机制研究究：结果解释释和对人的危危害性评价5、致癌强度度评价：肿瘤瘤发生率、潜潜伏期、啮齿齿类和人动力力学比较及其其它附加资料料(一)、试验验动物物种和品系：：要求用两种实实验动物，常常规选用大鼠鼠和小鼠，也也可用仓鼠。。(啮齿类因对多多数致癌物易易感性高，寿寿命相对较短短，费用较低低，生理和病病理学资料较较完备，而广广泛使用。)选择品系要求求较敏感、自自发肿瘤率低低、生命力强强及寿命较长长的品系。美国NCI(NationalCancerInstitute)推荐：Fischer344大大鼠和B6C3F1小鼠鼠性别：同等数量的雌雌雄两种性别别动物，即雌雌雄各半年龄：刚离乳动物(保证足够长的的染毒和发生生癌症时间，，且幼年解毒毒及免疫系统统未完善，对对致癌作用敏敏感)数量：满足统计学分分析的要求一般每组至少少雌雄各50只，希望在在出现第一个个肿瘤时，每每组还有不少少于25只动动物。动物数量需求求数与实验动动物肿瘤自发发率、受试物物诱发肿瘤发发生率有关。。如有两种以上上受试物同时时试验，可共共用对照组，，数量为雌雄雄各50×√受试物数数(二)剂量设设置一般原则：设3~5个剂剂量组、阴性性对照组，必必要时设阳性性对照组，阳阳性致癌物最最好与受试物物结构相近高剂量组：尽可能大，，可引起轻微微的毒性反应应，但不影响响正常生长、、发育和生命命。美国NCI推推荐以最大耐耐受量(MTD)为高剂剂量，MTD由90天毒毒性试验确定定，此剂量应应使动物体重重减轻不超过过对照组的10%，并且且不引起死亡亡及导致缩短短寿命的中毒毒症状或病理理损伤。ICH(1995)：①毒性终点；；即MTD；；②药代动力力学终点，啮啮齿动物血浆浆AUC为人人的25倍；；③选择吸收收饱和剂量；；④药效学终终点，不应产产生生理学和和内稳态紊乱乱；⑤最大可可行剂量，饲饲料中最高含含量为5%，，限制剂量为为1500mg∕kg∕∕天。中及低剂量组组：按等比级数数下推，如分分别为上一个个剂量水平的的1∕2或1∕3。低剂量组不产产生任何毒性性，但应高于于人的接触剂剂量，一般不不低于高剂量量的10%。。中剂量组介于于高、低剂量量之间，如有有可能按受试试物的毒物代代谢动力学性性质来确定。。(三)染毒方方式原则：根据受试物理理化性质和接接触方式，尽尽可能模拟人人体可能暴露露途径，主要要有经口、经经皮和吸入三三种。经口染毒：一般将受试物物掺入饲料或或饮水中连续续给予(5~7天∕周)。若掺入后后适口性不良良，可用灌胃胃法。掺入浓浓度要定期监监测，观察均均匀性和稳定定性，掺入浓浓度一般不超超过5%。经皮染毒：涂敷受试物的的面积一般不不少于动物体体表总面积的的10%。必必须保证良好好接触，并防防止动物舔食食。每天涂抹抹一次，每周周3~7次。。吸入染毒：每天染毒4小小时，每周5~7天。染染毒柜内受试试物浓度定期期监测，其分分布应均匀、、恒定。(四)试验期期限ICH(1995)建议议参考准则：：1、一般情况况下，小鼠和和仓鼠为18个月，大鼠鼠24个月；；对于某些生生命期较长或或自发肿瘤率率低的动物品品系，小鼠和和仓鼠可持续续24个月，，大鼠30个个月。2、当最低剂剂量组或对照照组存活动物物只有25%时，也可结结束试验;对对于有明显性性别差异的试试验，结束时时间对不同的的性别应有所所不同;在某某些情况下因因明显的毒性性作用，只造造成高剂量组组动物过早死死亡，此时不不应结束试验验。3、合格的阴阴性对照试验验标准：因饲饲养或管理问问题所造成的的动物损失在在任何一组都都不能高于10%，小鼠鼠和仓鼠在18个月，大大鼠在24个个月时各组存存活的动物不不少能于50%。(五)观察指指标1、一般观察察：每天观察察动物的一般般状况和毒性性反应，对死死亡动物及时时剖检。试验验最初三个月月每周称体重重一次，以后后每(2)4周称体重一一次。掺入饲饲料或饮水中中染毒时，应应记录食物消消耗量或饮水水量。2、肿肿瘤发发生情情况：：对每每一肉肉眼可可见及及或触触及的的肿瘤瘤，均均应记记录其其出现现时间间、部部位、、大小小、外外形、、发展展状况况和动动物死死亡时时间。。3、病病理检检查：：试验验过程程中死死亡或或濒死死而提提前处处理动动物，，及试试验结结束后后的全全部处处死动动物均均应进进行系系统尸尸检和和组织织病理理学检检查，，确定定肿瘤瘤的性性质和和靶器器官。。对已已经出出现肿肿瘤或或可疑疑肿瘤瘤的器器官和和肉眼眼检查查有明明显病病变的的器官官，应应注意意癌前前病变变。(六)结果果分析析统计各各种肿肿瘤的的数量量(包包括良良性和和恶性性)及及任何何少见见的肿肿瘤、、患肿肿瘤的的动物物数、、每只只动物物的肿肿瘤数数及肿肿瘤潜潜伏期期。1、肿肿瘤发发生率率(%)：：=(实实验结结束时时患肿肿瘤动动物总总数∕∕有效效动物物总数数)××100%有效动动物总总数为为最早早发现现肿瘤瘤时存存活动动物总总数2、肿肿瘤潜潜伏期期：即从摄摄入受受试物物起到到发现现肿瘤瘤的时时间，，可将将各组组第一一个动动物出出现肿肿瘤的的时间间作用用该组组的潜潜伏期期。内脏肿肿瘤不不易觉觉察，，通常常将肿肿瘤引引起动动物死死亡的的时间间定为为发生生肿瘤瘤的时时间。。3、肿