真菌荧光原位杂交技术-w

真菌荧光原位杂交技术-吴松松第一步：荧光探针标记。1,利用已知的特异序列送公司合成探针。各种情况的探针均适合，＜500bp的片段最好用此种方法。2，切口平移法。用DNApolymeraseI和DNaseI。适合较大的片段，一般＞7kb，1kb的片段效果较差。TOC\o"1-5"\h\z①IxDNApolymeraseIbuffer(1x)5口l②dNTP(10口M)5口l③Bio-11-dUTPorDig-11-dUTP(1mM)1.2口l④DNaseI(0.005U/口l)1口l⑤DNApolymeraseI(coli.10U/口)1.2口l⑥DNA(2.5口g)X口l⑦ddH2O36.6-X口l⑧Total50口l混匀后置于原位PCR或者于水浴锅中15℃4h，然后利用1%的琼脂糖凝胶检测片段大小，在100－500bp左右表示酶切完全，此时可停止反应。另有FISHTag™DNAMulticolorKit中也是切口平移法，但探针标记时需结合荧光染料，步骤比较复杂。3,随机引物法。用随机引物合成探针，此种方法适合cDNA片段为500〜1000bp的片段。①500ngDNAX口l②2.5XRandomPrimersSolution:口l20③10XdNTPMixture:口l24-X④口l24-X⑤KlenowFragment口l1.冰上操作：cDNA大约500ngDNA（5-201l）的离心管中加入0Ql2.5XRandomPrimersSolution.于沸水中变性5min,立即放于冰上.将融化的10XdNTPMixture及ddH2O提前放于冰上并依次力口入，轻轻混匀。.加入1QlKlenowFragmen轻轻混匀（剧烈震荡酶易失活），并低速离心30sce。.37℃孵育60min后力口入5QlStopBuffer。5.无水乙醇或异丙醇沉淀（加核酸助沉剂），75%乙醇清洗沉淀并用50QlDEPC-H2O溶解。6电泳检测探针质量。片段集中在250〜500bp质量较好，可用于原位杂交。第二步：样品的处理。PDB摇培3~5d的菌丝或者收集的真菌孢子分别用DEPC--H2O和IxPBS清洗一次，8000rpm离心。CSKBuffer处理。力口入CSKBuffer（0.5%TritonX-100,,10mMVRC或RRI）于4℃处理10~12min。第三步：样品的酶解与固定。1,用4%的多聚甲醛浸泡，于4℃暗处理1-4h。2,挑取菌丝或吸取孢子均匀涂与PE玻片上，风干使样品固定于玻片上。3,用DEPC-treated水洗两次，风干。用1xPBS渗透缓冲液覆盖（1%SDS,1%裂解酶，0.1%蜗牛酶），30°C,10min（实验中发现如果30min,菌丝降解的比较严重，因此可能应该减少酶解时间，15min）,用DEPC处理的水冲洗，晾干。然后用50%,80%和100%的乙醇进行脱水处理，每次5min。（参考文献：AlpineStreambyNewTaxon-SpecificInSituDetectionofFreshwaterFungi）第四步：杂交1，杂交液准备。2xhybridizationbuffer：4xSSC，40%硫酸葡聚糖，2mg/mlBSA，50%甲酰胺。将探针于95〜98℃变性5min后立即冰浴3min，以探针终浓度为0.56〜5ng/口l的浓度加入冰上预冷的杂交缓冲液中。探针浓度可以降低到2.5ng/ul（经过实验，该浓度的探针还是高，不过没有检测探针的质量，可以先检测探针的质量，200-500bp）。2，50D1体积片12片4片片8①100%去离子甲酰胺25Dl50Dl100Dl200Dl②20xSSCD5L10Dl20Dl40Dl③5%BSA(SS)0.5Dl1Dl2Dl4Dl④10xSDS2.5Dl5Dl10Dl20D⑤50%硫酸葡聚糖混匀，离心，然后加入10Dl20Dl40Dl80Dl3，⑥Bio-11-dUTP标记的探针50-100nLg/片10Dl20Dl4，⑦Dig-11-dUTP标记的探针50-100nLg/片10Dl20Dl5,6，杂交。每玻片100〜1501l杂交液滴加于样品上，盖膜与46℃暗盒（底部加入浸有2xSSC的吸水纸）中孵育过夜（16〜20h）。第五步：杂交后洗脱。1用2xSSC配制50%的甲酰胺溶液，42℃水浴预热，同时预热两份2xSSC溶液，预热20min以上。2把玻片从湿盒中拿出，于2xSSC揭膜。3于预热的甲酰胺中，42℃摇床摇10min，转入预热的2xSSC中摇两次，每次5min。第六步：标抗及结合链霉亲和素。1，地高辛标抗。①室温的2xSSC摇一次，5min。②4xSSC/Tween20（0.2%）摇一次，5min,（配制：1L4xSSC力口Tween2ml）。③每片加新鲜的5%BSA（4片配制：0.1gBSA+2ml1xPBS）100口l盖膜，室温放置5min,直接用镊子揭去盖膜。（以后每步避光）④配制anti-digFITC溶液（用5%BSA稀释75倍），每片加100口1,盖膜后湿盒中37℃温育1h。⑤4xSSC/Tween20（0.2%）摇洗3次，每次5min,1xpbs缓冲液中洗1次5min。2,生物素结合链霉亲和素。①IxPBS漂洗一次，5min。②5%的BSA100口1每片，盖膜，室温放置5min,揭膜。③用1：40配置Cy3耦联的链亲和素。每片50口1,盖膜，湿盒37度温育30min④1xPBS洗三次，每次5min第七步：DAPI负染与荧光信号检测1,5口g/ml的DAPI每片100口1。7,盖膜室温放置15min,1xPBS揭膜。8,每片加抗荧光猝灭剂一滴（10口1枪）。3,用干净的盖片盖好,于荧光显微镜下检测。4℃避光保存，完想保留玻片时：2xSSC摇10min,70%乙醇摇3min,100%乙醇摇3min,空气干燥。所需试剂准备20xSSC：0.3Msodiumcitrate,3MNaCl(pH7.0)CSKBuffer：100mMNaCl,300mMsucrose,3mMMgCl2,10mMPIPES(pH6.8)Storeat4°C.IxPBS：NaCl137mM,KCl2.7mM,Na2HPO410mM,KH2PO42mM(pH7.2〜7.4)4%多聚甲醛：2g多聚甲醛加入30ml1xPBS中，60℃加热10min后加入少量0.1MNaOH摇匀至多聚甲醛完全溶解后IxPBS定容至50ml。10ml:0.4g多聚甲醛力口7ml水，力口40ul5MNaOH,在定容至10ml注意事项1、做RNAFISH实验，首先要防止RNA酶的污染。操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套,并经常更换。所有实验用到玻璃制品都要高温灭菌,且各种溶液要用DEPC水配制。2、去污剂tritonX-100处理的目的是增加细胞的通透性，利于杂交探针进入细胞,其处理时间因应不同的细胞而有所不同。注意：过度的去污剂处可能会引起靶核酸的丢失。3、荧光见光就会淬灭,因此操作过程要做好避光。4、实验所用探针是双链DNA探针,而杂交反应进行时,探针和靶核酸都必须是单链的。因此在做RNAFISH杂交前,探针必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应,不然解链的探针又会重新复性。5、探针的浓度因其种类和实验要求而有所不同,一般为0.5-5ng/ul。合适的探针浓度要通过实验才能确定。6、杂交反应时,盖玻片不可有气泡,不然妨碍探针与细胞的接触。7、玻片经antifadereagent封片后可在4℃暗处保存2-3星期而不失去全部荧光，但FISH操作完成后要及时观察采图，地高辛标记的隔夜观察效果较好。8、如果镜检时，观察到