FDA药物相互作用指南

FDA药物相互作用研究指南药学部卢进2010.7.13介绍内容简介药物相互作用研究的背景知识药物相互作用研究的一般策略体内药物相互作用的实验设计药物代谢酶的确认CYP酶抑制/诱导作用的体外评价P-gp底物和抑制剂的体外实验研究简介美国FDA药物评价和研究中心(CDER)生物制品评价和研究中心(CBER)2006年9月共同发布药物相互作用研究-实验设计、数据分析及其在剂量调整和处方标签中的应用的指南简介指南为新药和新生物制品的研发者提供了：药物代谢药物转运体内体外相互作用研究规范简介内容涉及药物相互作用研究的全过程包括：实验设计研究人群或体外研究用细胞、微粒体探针底物、抑制剂、诱导剂的选择观察指标、样本量和数据统计分析，等除了代谢性药物相互作用以外，还对P糖蛋白介导的药物相互作用的研究方法给予了详细的指导（与1999年版本相比的增加内容）1.药物相互作用研究的背景知识包括细胞色素P450(CYP)酶在内的多个药物代谢酶都能被联用的药物所抑制/诱导药物浓度发生巨大改变影响药物安全性和有效性同时,药物转运蛋白相关的药物相互作用受到越来越多的关注如:P-gp、有机阴离子转运蛋白（OAT），等。表一：人类主要的转运蛋白和已知的底物、抑制剂、诱导剂2.药物相互研究的一般策略根据体外代谢、已知和诱导实验的结果及体内代谢实验数据确定体内相互作用研究必要性。流程图目前尚未发发现CYP2D6酶酶被诱导的的情况，而而CYP2C,CYP2B和P-gp是可以和CYP3A一起被诱导导的。CYP3A对所有已知知的诱导剂剂都很敏感。因此，考察察受试药物物能否能够够诱导CYP1A2,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19和和CYP3A时，只需要要体外考察察对CYP1A2和CYP3A酶的诱导情情况即可。。若体外实验验显示受试试药物对CYP3A无诱导作作用，那么么就可以免免做对CYP2C和和CYP2B的诱导导研究。3.体内药药物相互作作用实验设设计实验设计研究群体底物和作用用药物的选选择给药途径给药剂量3.1实验验设计思路：比较较底物（S）浓度在有和没有作用药物（（I）时的变化化情况。随机交叉法法（先服用S后服用S+I组、先服用用S+I组后服用S组）单次序交叉叉法（总是先服服用S后服用S+I组、或相反反）平行设计（一组服用用S,一组服用用S+I）设计方案时时应该注意意：(1)如如果实验需需要达到稳稳态血药浓浓度而底物物或作用药药物和(或或)其代谢谢物的半衰衰期较长,此时不能采用额外外给予一个负负荷剂量的方方法加快达到稳态态。(2)如果作作用药物是一一个快速可逆逆的抑制剂,其服用时间间应该在测定定当天服用底底物前或同时时服用,这样样才能增加其其敏感性。对于基于作用用机制的抑制制剂(如红霉霉素),在在服用底物药药物前服用作用药物物可以放大相互作用用强度。如果作用药物物(抑制剂或或诱导剂)的的吸收受多种种因素的影响响(如胃pH值),则则需要采取适适当的方法控制吸收方面的变变化。(3)为了了排除由于食食物、饮料、、果汁等影响响代谢酶和转转运蛋白而引引起误差,指指南建议实验验过程中要严格控制饮食食。3.2研究究群体一般是健康受试者。在特定环境下下，受试药物物表现的治疗疗效果或者药药效学效果不在健康者身身上出现，此时要从患者群体中招募受试者者。药物相互作用用的程度可能能因受试者某某个具体CYP酶的基因因型不同而有有所差异。3.3底物物和作用药物物的选择表二：指南推推荐的CYP酶底物。“鸡尾酒”模模式释义：在一个个实验中受试试者同时服用用多种CYP酶酶底物。实验设计需考考虑下列因素素：(1)一种特特定酶的底物物对该酶具有有较高的选择择性;(2)底物之之间没有相互互作用发生;(3)受试者者的数量达到到统计学要求求。(4)药物浓浓度变化在安安全范围内;(5)入选的的CYP酶都都参与药物代代谢消除;(6)药物其其他代谢途径径或者不被抑抑制的途径的的药物清除率率低。评价：这种鸡尾酒实实验的阴性结结果可以免除除对其中某个个具体酶的进进一步评价,然而阳性结果则需需要进一步的的体内研究。鸡尾酒实验可可比单个相互互作用研究提提供更多的信信息,而结论论的确定程度度取决于药物物其他不被抑抑制的代谢途途径的清除率率分数(清除率分数越越小,确定程程度越高)。如果单一的相相互作用实验验显示抑制效效应可以导致致严重的安全全隐患,则不不能进行鸡尾尾酒设计法。。3.4给药药途径受试药物的给给药途径应与与将来临床应用用的方式一致。。体内相互作用用研究采取的的给药方式取取决于未来上市剂型型。3.5给给药剂量实验设计应尽尽可能将底物物和作用药物物相互作用的的结果最大化，因此指南推推荐作用药物物（抑制剂/诱导剂）使使用最大安全剂量量和最短给药药间隔。当使用低于临床常用剂量量的给药方案案时，体内药药物相互作用用研究方案应应在结果报告告中进行讨论。4.药物代代谢酶的确认认如果某个酶对对药物的代谢谢量占整个药药物消除量>25%,则可以确认认此酶是药物物的主要代谢谢酶。将药物和肝细细胞或肝切片片一起孵育,然后通过色色谱方法分析析孵育介质和和细胞内药物物浓度,这种种方法可以直直接获得氧化化、水解或基基团转移形成成的代谢物,提供平行代代谢还是先后后代谢的信息息。另一种方法是是用HPLC来分析孵育育介质。实验验还需要优化化介质中受试试药物浓度和和孵育时间。。临床预期的的稳态血药浓浓度可以用来来指导体外实实验介质中药药物浓度的选选择。有三种方法可可以很好地确确认不同的CYP酶对药药物代谢的贡贡献:(1)特定的的化学物质或或抗体作为特特定酶的抑制制剂表5：列出了常用的的特异性化学抑制剂。。在确定代谢酶酶种类及其在在药物代谢中中的相对贡献献时,药物的浓度要要≤Km值,而抑制剂的的浓度既要保保证其选择性性又要保证足足够的量,所所以可以采用用一系列的抑抑制剂浓度。。当使用基于于作用机制的的抑制剂时,最好将抑制制剂与酶预先先孵育15～30min。。(2)应用不不同的人重组组CYP酶,这种技术对对研究单个CYP酶在整整个药物代谢谢中的相对贡贡献的大小具具有很高的价价值,但不能能代表人肝微微粒体酶中的的绝对的代谢谢比率。(3)根据不不同供体来源源的CYP酶酶不同活性建建立人肝微粒粒体库。指南建议至少少采用上述两两种方法来确确认药物代谢谢酶5.CYP酶抑制作用用的体外评价价Review:Ki：抑制率常数数，抑制作用用越强，此值值越小IC50：反应被抑制制一半时抑制制剂的浓度，，越低表明抑抑制剂的抑制制能力越强。。5.CYP酶抑制作用用的体外评价价CYP酶抑制制剂体外实验验设计注意事项:(1)IC50测定时,在底底物代谢率允允许的情况下下,尽量使底底物的浓度低低于其Km值,使IC50与其Ki值更具相相关性;(2)肝微粒粒体蛋白浓度度通常<1g·L-1;(3)缓冲液液的性质、pH对Vmax和Km的影响显显著,尽可能能采用标准化化的分析条件件;(4)反应系系统中最好控控制底物或抑抑制剂的消耗耗不超过10%～30%,但是对于于Km值很低的的药物来说,控制反应体体系底物消耗耗<10%很很困难;(5)建议建建立时间-产产物形成量的的线性关系;(6)建议建建立酶量-产产物形成量的的线性关系;(7)因为某某些有机溶剂剂具有酶诱导导或抑制作用用,溶剂的浓浓度都要<1%(v/v),最好<0.1%,实验应包包括无溶剂对对照和溶剂对对照;(8)实验应应该有一个已已知抑制剂的的阳性对照。。相互作用程度度的模拟：R=1+[I]/Ki（[I]代代表作用部位位抑制剂的浓浓度,Ki是抑制常常数）指南推荐体内内相互作用的的可能性通过过[I]/Ki来推断,[I]代表表服用临床最最大用药量后后平均稳态的的药物浓度(游离或结合合的全部药物物),比值值升高,产生生相互作用的的可能性增大大。尽管通过体外外数据定量预预测体内相互互作用发生的的可能性存在在困难,但可可以通过同一个药物对不同CYP酶(CYP1A2,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19、、CYP2D6和CYP3A)的Ki值进行筛筛选排序,体体内实验从[I]/Ki最大者(或者Ki最小者)的CYP酶开始始,如果实验验显示体内不存在药物相互作用用,其他的[I]/Ki相对较小的CYP酶的体体内实验就可可以不做。6.CYP酶诱导作用用的体外评价价实验设计中应应包括一个公公认的酶诱导导剂作为阳性性对照,来减减小不同供体体酶催化活性性差异引起的的误差。表7:诱导剂剂选择列表实验中应注意意：(1)受试药药物的浓度应应该参考临床床治疗剂量的的血药浓度,至少包括3个涵盖治疗疗窗的筛选浓浓度,其中至至少1个浓度度要超过平均均预期治疗浓浓度1个数量量级;(2)与肝肝细胞共孵育育2～3d后,通过CYP特异的的探针药物(参考指南推推荐)测定酶酶活性;(3)使用新新鲜分离的或或者冻存的肝肝细胞进行实实验时,应该该至少选择3份不同的供供体以减少诱诱导实验中存存在的个体差差异。评价药物酶诱导作用时,指南南建议:(1)药物体体外实验引起起的酶活性的的改变≥40%阳性性对照结果时时,可以认为药药物具有酶诱诱导作用,需需要进一步的的体内研究;(2)EC50可以用来比较较不同诱导剂剂诱导能力力的强弱;(3)指南认认为,根据目目前了解的CYP酶诱导导的细胞学机机制,如果果一个诱导实实验显示对CYP3A4酶没有诱导作作用,可以以推断此药物物对CYP2C8,CYP2C9和CYP2C19也没有诱导作用。7.P-gp底物和抑抑制剂的体外外实验研究考察药物是否否是P-gp的底物或抑抑制剂,最常常见的方法有有哪些？双向转运测定定法由于更直接,因此被作作为标准的方方法。ATP酶活性性测定法和摄摄取/外排法法可以用于快速速筛选,但是是不能区分是是底物还是抑抑制剂。如果果药物透过性性(膜扩散能能力)低,ATP酶法和和荧光定量法法常常无法识识别是否是P-gp的底底物。对高通透性化化合物,双向转运测定定法也不适用。这些底物作为为阳性对照，，保证实验用用细胞能够表表达功能性的的P-gp.7.1双向转运实验验确定药物是是否是P-gp的底物选择好细胞系系和P-gp底物阳性对对照后,遵循循下列步骤完完成实验:(1)设计几几个不同的药药物浓度(如如1,10,100μmol··L-1)考察P-gp对对药物的外排排作用;(2)实验开开始前,将极极性细胞组成成的膜两侧的的介质去掉,加入新的介介质并孵育30min;(3)进行双双向膜转运通通透性研究:在极性膜的的A侧(apical侧,腔侧,顶区侧,转转运方向是A→B)或B侧(basolateral侧,基基底侧,转运运方向是B→→A)加入入适量体积的的含有已知P-gp底物物或受试药物物的缓冲液;(4)在37°C孵育,在预定的时时间(通常是是1,2,3,4h)收集集受侧的介质质测定药物浓浓度,同时迅迅速补充缓冲冲液;(5)已知P-gp底物物作为阳性对对照进行同样样的实验;(6)当采采用LLC2PK1-MDR1MDCK-MDR1作作为实验细胞胞系时,相应应的野生型细细胞系LLC-PK1和和MDCK作作为阴性对照照;(7)每每个个实实验验至至少少在在不不同同日日期期重重复复3次次,考考察察日日间间和和日日内内变变异异情情况况;(8)理理想想的的实实验验还还应应该该测测定定底底物物的的回回收收率率,来来消消药药物物代代谢谢和和非非特特异异性性结结合合带带来来的的误误差差由于于Caco-2、、野野生生型型的的LLC-PK1和和MDCK也也能能表表达达其其他他外外排排转转运运蛋蛋白白,因因此此在在评评价价药药物物是是否否是是P-gp底底物物时时要要谨谨慎慎,为为增增加加实实验验的的可可信信性性,建建议议增增加加P-gp抑抑制制剂剂(表表10)存存在在下下的的底底物物验验证证实实验验,如如果果药药物物的的外外排排可可被被P-gp抑抑制制剂剂明明显显抑抑制制,则则说说明明药药物物的的外外排排与与P-gp有有关关。。指南南还还建建议议,可可以以通通过过实实验验对对比比MDR1过过度度表表达达细细胞胞(转转染染型型细细胞胞)和和它它们们的的野野生生型型细细胞胞对对药药物物外外排排活活性性的的差差异异,确确定定P-gp在在药药物物外外排排中中的的贡贡献献大大小小。。利用用下下列列公公式式描描述述药药物物跨跨膜膜表表观观通通透透性性:Papp=(Vr/c0)(1/S)(dc/dt)其中中,Vr是是极极性性膜膜受受侧侧介介质质体体积积,c0是指指膜膜供供侧侧实实验验药药物物的的浓浓度度,S是指极极性细细胞形形成的的膜的的面积积,dc/dt是受侧侧介质质药物物浓度度与时时间曲曲线的的斜率率。准准确计计算Papp必须须要求求受侧侧药物物浓度度与时时间是是直线线关系系。药物经经P-gp外排排速率率RE可以以通过过下列列公式式计算算:RE=PB/A/PA/BPB/A和和PA/B分分别代代表受受试药药物B→→A和和A→→B的的跨跨膜表表观通通透性性。7.2双向转转运实实验确确定药药物是是否是是P-gp抑制制剂(1)使使用Caco-2细细胞系系时,要使使用无无药介介质作作为空空白对对照,测试试药物物的浓浓度要要适宜宜;(2)当当采用用LLC-PK1-MDR1和和MDCK-MDR1作作为实实验细细胞系系时,相应应的野野生型型细胞胞系LLC-PK1和MDCK作作为阴阴性对对照;(3)37℃℃孵育育细胞胞系0.5～1h后,去除除孵育育介质质,换换成浓浓度合合适的的P-gp探针针底物物(表表9);(4)孵育育细胞胞系1～3h后,测定定受侧侧介质质中P-gp探探针底底物的的浓度度;(5)每个个实验验至少少在不不同日日期重重复3次,每个个实验验也要要用至至少3个极极性细细胞膜膜进行行测定定。7.3受试药药是否否是P-gp底底物物或抑抑制剂剂,以以及是是否需需要要进行行体内内实验验的判判定流流程7.4潜在P-gp诱诱导药药物的的确定定P-gp的的表达达可被被诱导导,已已知的的诱导导剂包包括利福平平和圣圣约翰翰草.P-gp对对其其诱导导剂的的反应应存在在明显显的物种差差异,因此此动物物实验验不能能用来来评价价受试试药对对人P-gp的的诱导导效应应.P-gp的