兽医现代监测诊断技术培训课件

兽医现代监测诊断技术

张东

四川省动物疫病预防控制中心研究员兽医监测诊断技术在动物疫病防控和兽医公共卫生工作中具有重要作用，是预防、控制和扑灭重大动物疫病中的重要一环，为养殖业健康发展和公共卫生安全提供保障。前言提纲面临的复杂形势

动物疫病诊断技术现状

检测技术发展方向与未来展望

1面临的复杂形势

动物疫病种类多

农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》中列入157种；其中一类17种；二类77种；三类63种。OIE《陆生动物卫生法典》2010版中列入94种；包括多种动物共患病26种；牛病14种；绵羊和山羊病11种；马病11种；猪病8种；禽病14种；兔病2种；蜂病6种；其他疫病2种。新发动物疫病威胁国外威胁：非洲猪瘟（俄罗斯）等；周边省威胁：小反刍兽疫（西藏）、

口蹄疫A型（2008年湖北）等；新发亚型：口蹄疫亚洲I型（2005年出现）等。动物疫病病原型别多、变异快口蹄疫：7个型，多个亚型；我国O型、亚洲I型（2005年4月传入中国）、A型流感：A、B、C3个型；A型：H1~H16亚型；H5亚型：变异株不断出现……疫苗：-1、-4、-5株……PRRS：1996年美洲型；2006年变异株；2009年欧洲型1株。另外，还有小反刍兽疫（西藏）、疯牛病、非洲猪瘟、尼帕病……等外来重大疫病的威胁2010年列入国家监测计划的动物疫病（16种）高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性蓝耳病、猪瘟鸡新城疫、布鲁菌病、牛结核病、血吸虫病、狂犬病牛海绵状脑病、痒病、牛传染性胸膜肺炎、牛瘟、小反刍兽疫、非洲猪瘟、蓝舌病国家强制免疫动物疫病外来动物疫病主要疫病的国家指定监测方法病名指定诊断方法口蹄疫正向间接血凝试验、液相阻断ELISAVP1-ELISA高致病性禽流感血凝抑制试验（HI）猪瘟正向间接血凝试验、阻断ELISA高致病性猪蓝耳病ELISA、鸡新城疫血凝抑制试验（HI）布鲁菌病虎红平板试验、试管凝集试验血吸虫病斑点ELISA、免疫金标快速试纸条牛结核病结核菌素变态反应试验地市级、县级实验室的适用试验技术县级实验室地市级实验室凝集试验（高致病性禽流感、口蹄疫、猪瘟、新城疫等病）；ELISA（猪瘟、口蹄疫、高致病性蓝耳病等病）县级实验室开展的试验技术RT-PCR技术（猪瘟，PRRS等病）省内诊断试剂剂使用的现状状主要诊断试剂剂提供单位有：：兰州兽医研究究所哈尔滨兽医研研究所猪瘟和口蹄疫疫O型正向间接血血凝；口蹄疫Ａ型、、Asia—I和O型液相阻断ELISA；3ABC-ELISA，VP1-ELISA；猪圆环病毒ELISA；禽流感H5血凝抑制抗原；；鸡新城疫血凝凝抑制抗原；；其他：猪蓝耳病ELISA——法国进口；猪伪狂犬、猪猪细小病毒ELISA——荷兰赛迪诊断断公司；猪蓝耳病RT-PCR，猪乙型脑炎炎RT-PCR，猪细小病毒PCR等——北京爱德士元元亨生物技术术有限公司。。疫苗种类各异异、诊断试剂剂和方法多样样以口蹄疫为例例抗体检测试剂剂品种病原检测试剂剂品种正向间接血凝凝琼脂凝胶免疫疫扩散试剂液相阻断ELISA试剂盒非结构蛋白ELISA试剂盒(3ABC)结构蛋白ELISA试剂盒（VP1）免疫胶体金试试剂盒（测抗抗体）RT-PCR试剂盒荧光RT-PCR试剂盒ELISA试剂盒免疫胶体金试试剂盒（测抗抗原）反向间接血凝凝试剂国内动物疫病病诊断试剂存存在的主要问问题技术方法：标标准?各企业生产诊诊断试剂的的的标准不一。。诊断试剂：文文号？302个产品中，有有新兽药证书书产品7.6%，有生产批准准文号产品4.3%，列入标准产产品7%。法规管理：完完善？市场秩序混乱乱：国内生产产企业不具有有资质、产品品无新兽药证证书或批准文文号、国外生产企业业注册生产的的产品进入国国内未经注册册、非法生产产产品产品质质量：：不齐齐？1.质量水水平低低，试试验特特异性性不高高，产产品保保质期期短；；2.适用范范围窄窄，操操作复复杂；；3.生产能能力小小，购购买难难；4.检测目目的不不明确确（型型/亚型、、感染染/免疫抗抗体等等）。。国外动动物疫疫病诊诊断试试剂进口兽兽用诊诊断试试剂质质量好好，但但是成成本高高、购购买周周期长长，有有的不不适合合中国国的实实际情情况。。国内兽兽用诊诊断试试剂问问题之之根源源行业特特点产品种种类多多，成成分复复杂，，生命命周期期长，，技术术含量量高，，质量量要求求严格格，单单位用用量小小投入资资金巨巨大，，产品品开发发周期期长监管措措施不不完善善研发：：基础础研究究、高高科技技研究究投入入力度度小，，科研研与生生产脱脱节。。生产、、经营营：企企业规规模小小、效效率低低、利利润低低，发发展不不均衡衡，且且部分分没有有生产产资质质；诊诊断试试剂注注册审审批程程序繁繁琐，，进入入市场场门槛槛高。。使用：：盲目目选择择诊断断试剂剂，采采购、、验收收、保保藏制制度不不健全全。产业化化和商商品化化发展展滞后后，非非法诊诊断试试剂产产品市市场占占有比比例大大。动物疫疫病诊诊断试试剂行行业发发展建建议先进的的产学学研模模式，，提高高自主主创新新能力力，建建设科科研院院所和和企业业的产产业链链严格市市场准准入完善的的质量量监控控体系系，进进行规规范化化、标标准化化管理理达到扩扩充兽兽用诊诊断试试剂种种类，，提高高产品品质量量，满满足动动物疫疫病监监测、、诊断断工作作需要要2动物疫疫病诊诊断技技术现现状常用实实验室室检测测技术术组织病病理学学检测测技术术血清学学检测测技术术分子生生物学学检测测技术术病原学学检测测技术术组织病病理学学检测测技术术1.病理学学检测测技术术是利用用疫病病引起起的动动物组组织发发生特特征性性的病病变和和病理理变化化对动动物疫疫病进进行诊诊断。。2.免疫病病理学学检测测技术术(免疫组组织化化学技技术)免疫组组织化化学方方法不不仅可可在脏脏器组组织中中特异异地检检出病病原,又可发发挥病病理学学检测测所具具有直直观、、抗原原定位位准确确的特特点,还可在在脏器器组织织原位位检测测出病病原（（原位位PCR）的同同时，，观察察到组组织病病变与与该病病原的的关系系，从从而有有助于于了解解疫病病的发发病机机理和和病理理过程程。血清清学学检检测测技技术术按其其反反应应性性质质的的不不同同可可分分为为：：凝集集性性反反应应(如凝凝集集试试验验和和沉沉淀淀试试验验)标记记抗抗体体技技术术(包括括荧荧光光抗抗体体、、酶酶标标抗抗体体、、放放射射性性标标记记抗抗体体等等特点点：：敏感感、、快快速速（（ELISA只需需要要1~2小时时））。。补体体参参与与的的反反应应(补体体结结合合试试验验、、免免疫疫粘粘附附血血凝凝试试验验等等)。中和和试试验验(病毒毒中中和和试试验验和和毒毒素素中中和和试试验验)特点点：：时间间长长，，约约需需要要18小时时才才能能获获得得结结果果。。免疫疫转转印印技技术术。正向向间间接接血血凝凝诊诊断断技技术术特点点：：正向向间间接接血血凝凝为为一一种种微微量量的的定定量量反反应应试试验验，，其其应应用用广广泛泛，，其其无无需需昂昂贵贵的的设设备备，，操操作作简简单单，，并并且且有有快快速速、、敏敏感感、、特特异异性性。。操作作要要点点及及注注意意事事项项：：A.试验验准准备备：：采集集3只以以上上未未免免疫疫鸡鸡全全血血混混合合制制红红细细胞胞悬悬液液；；选用用孔孔底底应应光光洁洁透透明明无无可可见见沉沉淀淀附附着着物物的的反反应应板板(一次次性性的的最最好好)；待检检血血清清要要新新鲜鲜，，未未腐腐败败、、溶溶血血，，无无悬悬浮浮物物。。B.操作作过过程程：：尽可可能能的的保保证证样样品品被被全全部部加加入入反反应应孔孔；；每每次次滴滴加加抗抗原原前前应应充充分分摇摇匀匀，，从从稀稀释释度度高高的的孔孔开开始始加加起起，，并并避避免免滴滴头头和和孔孔内内的的液液体体直直接接接接触触；；避避免免稀稀释释时时孔孔内内产产生生气气泡泡，，直直接接影影响响结结果果判判定定。。C.结果果判判定定：：正确确识识别别“++”的凝凝集集现现象象。。待检样品2待检样品1阳性对照阴性对照正向向间间接接血血凝凝反反应应原原理理图图间接接血血凝凝抑抑制制反反应应原原理理示示意意图图红细胞间接血凝反应原理示意图抗体致敏红细胞联免免疫疫吸吸附附试试验验（（ELISA）具有有灵敏敏度度高高、、特特异异性性强强、、快快速速、、简简便便、、重重复复性性好好、、安安全全、、适适合合大大批批量量标标准准化化检检测测的特特点点。。是当当前前应应用用最最广广、、发发展展最最快快的的一一项项新新技技术术，，目目前前该该方方法法已已被被广广泛泛用用于于多多种种细细菌菌和和病病毒毒等等疾疾病病的的诊诊断断。。其基本本过程程是将将抗原原(或抗体体)吸附于于固相相载体体，在在载体体上进进行免免疫酶酶反应应，底底物显显色后后用分分光光光度计计或酶酶标仪仪判定定结果果。其可分分为以以下几几种方方法：：原理及及分类常用的的直接接法ELISA（测抗抗体））分子生生物学学检测测技术术用于动动物疫疫病特特异性性快速速诊断断和病病原基基因变变异与与进化化分析析，及及时准准确掌掌握动动物疫疫病分分子流流行病病学动动态，，为疫疫病防防治提提供基基因理理论分分析依依据。。核酸探探针技技术、、基因因序列列分析析比如基基因芯芯片试试剂盒盒。聚合酶酶链反反应（（PCR）（应用最最广））疫病的的早期期诊断断和不不完整整病原原的检检测快速、、准确确、安安全的的检测测病原原体在病原原体分分类和和鉴别别中的的应用用PCR仪基因芯片仪聚合酶酶链式式反应应（PCR)是以DNA变性、、复制制的某某些特特性为为原理理设计计的。。通过过PCR技术获获取病病原微微生物物的特特异DNA片段，，从而而为疾疾病诊诊断提提供重重要依依据。。特点：：快速速；敏感；；步骤较较多。。PCR反应原理图反转录录PCR技术即RT-PCR技术。。用于于检测测RNA病毒。。首先提提取总总RNA，然后后加入入引物物在反反转录录酶的的作用用下合合成cDNA，加热热变性性成为为单链链cDNA后，加加入与与之互互补的的另一一引物物，进进行PCR反应。。分为一一步法法和两两步法法两种种RTRT-PCR反应原理图多重PCR技术(Multi-PCR）它是一一种特特殊的的PCR形形式，，其最最突出出的特特点是是一次次PCR反反应．．在同同一反反应体体系中中同时时加入入多对对不同同PCR引引物和和相应应的模模板，，可同同时检检测、、鉴别别出多多种病病原体体，在临床床混合合感染染的鉴鉴别诊诊断上上具有有其独独特优优势和和很高高的实实用价价值。病原学学检测测技术术1.细菌的的分离离与鉴鉴定2.病毒的的分离离与鉴鉴定是病毒毒性疫疫病检检测、、诊断断、流流行病病学调调查和和未知知新病病毒进进行分分类鉴鉴定的的重要要方法法之一一。如如，此此法称称为检检测口口蹄疫疫的黄黄金标标准。。但是是对实实验室室能力力要求求较高高，且且耗时时长。。3.寄生虫虫检测测寄生虫虫病诊诊断中中其定定性的的实质质性方方法有有以下下几种种:虫卵检检查法法、虫虫体检检查法法、免免疫学学检查查法和和分子子生物物学检检查法法。诊断新新技术术及应应用我国免免疫预预防为为主的的动物物防疫疫政策策，决决定了了在现现实的的动物物疫病病监测测工作作中，，迫切切需要要实用用的对对动物物疫病病病原原的快速诊诊断技技术以及能能区分免疫动动物和自然然感染动物物的鉴别诊诊断技术。目前国内符符合上述要要求的诊断断新技术主主要有以下下3种:1.免疫胶体金金快速诊断断试纸条2.荧光PCR3.鉴别诊断技技术4.原位PCR技术免疫胶体金金快速诊断断试纸条特点：操作简易，，速度快快快，10分钟内出结结果，方便便基层开展展工作目前已经有有了口蹄疫疫、猪瘟、、禽流感、、血吸虫等等病的胶体体金快速诊诊断试纸条条。技术原理：：试纸条的正面和侧面免疫层析快速检测试纸结结构及原理实时荧光定定量PCR与普通PCR相比：1.自动化程度度高，极短短的检测时时间（没有了制制胶和PCR产物电泳步步骤，快速速热循环仪仪也缩减了了运行时间间，在30分钟内可以以得到完美美的实验结结果）；；2.敏感性为普普通PCR的100倍；3.直观的软件件分析；4.有效解决PCR污染问题；；5.安全性更好好。6.不足：资金投入大大，检测成本高高。实时荧光定量PCR反应软件分析截图实时荧光定量PCR仪鉴别诊断技技术鉴别诊断技技术的重要要性：A：区分自然然感染抗体体和疫苗免免疫抗体的的鉴别诊断断技术；B：从普遍免免疫的动物物群体中甄甄别出自然然感染和带带毒的动物物。该项技术的的核心是基基因工程技技术、单克隆抗体体技术与诊断技术术的综合运运用，其科科技水平高高，研究的的难度叶较较大。单克隆抗体体技术目前市场上上已有部分分利用单克克隆抗体制制备的金标标快速检测测卡和ELISA试剂盒（（比如猪瘟瘟）。原位PCR——分子病理学学新技术是一种将PCR技术与原位位杂交技术术结合起来来的可以检检测组织细细胞中微量量DNA或RNA且可精确定定位的新技技术。特点：敏感度更高高，优于免免疫组化技技术。目前应用情情况：主要