肺结核实验室诊断(马小玲)课件

结核分枝杆菌的试验室诊断安徽省立医院检验科马筱玲1结核疫情及诊断进展

2黛玉脸色苍白，瘦骨嶙峋，经不断

咳嗽及吐血后，香消玉殒，结束了一场哀怨凄绝的爱情故事。3

结核病实验室

诊断方法介绍5概述结核病人的细菌学检查不仅是发现传染源的主要途径和手段，也是结核病确诊和制订抗痨方案，考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。由于结核菌的遗传特性决定其生长周期长，致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度低、操作复杂，需时间较长和影响因素较多，不易标准化等缺陷，使细菌学诊断发展缓慢，无法充分满足临床诊断的需要。6实验室诊断方法病原学诊断辅助诊断

7病原学诊断一、涂片抗酸染色镜检法，二、液基夹层杯结核杆菌检验三、荧光染色法四、培养法五、液体培养＋显微镜观察药敏试验六、快速培养检测法，七、色谱法八、分子生物学法

九、噬菌体生物扩增法8涂片优点：简便、快速、价廉

10痰菌假阴性原因病变是封闭或开放；病变性质和其中能够排出的菌量和排出时间间歇；结核分枝杆菌形态多样性；12优点：1、操作方便，易于掌握。2、片中结核菌分布均匀，染色效果清晰3、液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提高：该方法将所有消化后标本的抗酸杆菌均完整地保留于液基薄片中，从而显著提高了检出率。4、安全性有所提高：消化，制片，烤片，染色均在彭氏杯中完成，操作人员不直接接触标本。采用结核专用消化液，可有效杀灭结核分支杆菌，更好的提高了操作的安全性。14三、荧光染色法：是涂片法中阳性率较高，较快速的方法，集菌与荧光染色相结合，则荧光显微镜下的抗酸杆菌阳性率可达50%，荧光法的缺点：假阳性率较高，保存时间短，不到4个月15四、培养法一般都用改良罗氏固体培养基接种后第3第7天观察，以后每周观察一次菌落生长情况，第8周若仍无生长，报告为阴性。优点：准确，灵敏度略高于涂片法；可以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种鉴定和药敏试验.缺点：诊断周期长，最快也需要6周。有一定的污染率1617培养假阴性的原因个别细菌营养要求的特异性；细菌和细菌营养代谢异质性；细菌培养前处理对细菌活性影响；18检测方法1．菌悬液的制备2.接种及培养3.结果判定与报告敏感（一）：含药培养基上无菌落生长。报告菌落数：当含药培养基上菌落数在20个以下时，报告菌落个数。耐药（1+）：含药培养基上菌落数约占斜面面积1/4；耐药（2+）：含药培养基上菌落数约占斜面面积1/2；耐药（3+）：含药培养基上菌落数约占斜面面积3/4；耐药(4+)：含药培养基上菌落呈菌苔样生长。20

本法弊端

操作繁琐需时久，4周结果准确性差21

液体培养

+

显微镜观察23结论本试剂检测简便，快速，3天就可获得多耐药结核杆菌的检测结果，同时具有较高的敏感性和特异性，与常规方法符合率较高，可用于多耐药结核病的快速检测。痰标本直接药敏试验比常规方法提早6～8周，更具有快速诊断价值。本试剂费用低廉，不需特殊仪器设备，适合基层推广应用。本法安全、对预防耐药结核病的流行与传播、防止实验室工作人员的感染具有重要意义。241.BDBACTECMGIT960培养系统

基本原理

培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显示剂为氧抑制性，当分支杆菌生长使氧消耗后，荧光显示剂被激活，而发出荧光。检测仪测试荧光强度，并判定结果。优点：快速7-14天培养阳性

简便比常规法操作简便，培养阳性率高于L-J法缺点：无法观察菌落形态，污染率略高于L-J法，产品依赖进口，价格较贵262．BacTALERT3D培养系统原理：该系统采用产色检测技术检测培养系统中分支杆菌生长情况。因其所用的培养瓶底部有颜色感应器，当培养瓶中有细菌生长，C02产生、pH下降时，颜色感应器由绿色变成黄色。仪器自动连续检测，检测的数据输入计算机，根据计算结果自动显示培养瓶中有无分支杆菌生长。优点：快速7-14天培养阳性

简便比常规法操作简便，培养阳性率高于L-J法缺点：无法观察菌落形态，污染率略高于L-J法，产品依赖进口，价格较贵。27七、色谱法

分为气相色谱(GC)、气液相色谱、高效液相色谱(HPLC)等GC等能检测分枝杆菌代谢过程中的挥发性物质如脂肪酸所产生的CO2含量，出现不同的色谱峰，从而可鉴定结核杆菌和大部分NTM菌种，且可测药敏。优点：简单、快速、定量、重复性好，GC与质谱(MS)联用更好；缺点：仪器昂贵，维护不易，无法普及。

281、聚合酶链反应(PCR)：PCR能快速扩增结核分枝杆菌DNA，PCR检测假阳性和假阴性问题是影响其应用的关键问题。对于存在的问题对策如下：扩增产物特异性鉴定－探针杂交高质量试剂（建立国家级检定考评）规范化操作（培训操作人员）质量控制（标准实验室）302、核酸探针(DNA-probe)DNA探针是一小段带标记而能识别特异性核苷酸序列的单链分子。3、染色体核酸指纹法：有多种方法，如限制性内切酶图谱(REA)和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析等，RFLP用于菌株菌种鉴定和流行病学调查研究。314、16s～23srDNA(rRNA)序列法用于分枝杆菌的菌种鉴定，差不多所有种的分枝杆菌都可鉴定出来。5、耐药基因的检则：已查出的结核杆菌耐药基因有rpoB(对利福平)，Kat、inhA、ahpC(对异烟肼)，embl(对乙胺丁醇)，rpsL、rrs(对链霉素)，pncA(对吡嗪酰胺)和gyrA(对氟喹诺酮类，gyrB则为低度耐药)等。32九、噬菌体生物扩增法（PhaB）该法1997建立，并用于结核分枝杆菌耐药性测定。近年来进展很快。33检测原理

分枝杆菌噬菌体能感染活的分枝杆菌，并在菌体内增殖，裂解菌体，释放出的子代噬菌体，即可感染随后加入的指示细胞（也是一种分枝杆菌），并使指示细胞裂解，在培养皿上出现噬菌斑。若先将待检菌株与某种药物作用一段时间后在加噬菌体检测，并以不加药管为对照，根据含药管和不含药管出现的噬菌斑情况即可判断细菌的耐药性。34噬菌体

－病毒核酸衣壳只能在活的易感細胞內生長溶原性感染和溶菌性感染35M.tuberculosiscell特异性噬菌体识别MTB,并与之结合36噬菌体DNA进入MTB细胞,并在其内扩增;同时生产蛋白外壳,开始产生新的病毒颗粒DNA37添加特异性杀病毒剂去除所有MTB胞外的噬菌体,胞内噬菌体不受损伤。38终止杀病毒反应，添加非致病性，快生长分枝杆菌（敏感细胞）39结核分枝杆菌破裂，释放噬菌体。40MTB细胞周围的敏感细胞，并在其胞内增殖41经过多个“感染—增殖—细胞消融”循环，在琼脂培养基中的菌苔上形成肉眼可见，清晰的噬菌斑4243结核分枝杆菌杀病毒剂杀灭未感染MTB的噬菌体敏感细胞敏感细胞敏感细胞敏感细胞MTB裂解,释放出来的噬菌体感染敏感细胞噬菌体感染结核分枝杆菌产生噬菌斑先以特异性噬菌体感染、裂解标本中的结核分枝杆菌，再用杀病毒剂清除所有未感染MTB的噬菌体，而结核分枝杆菌胞内的噬菌体继续扩增，进而裂解细胞，释放噬菌体。裂解释放的噬菌体感染随即添加的敏感细胞，在其胞内扩增并裂解敏感细胞，敏感细胞菌苔上肉眼可见的噬菌斑。如待检标本不含结核分枝杆菌，噬菌体被杀病毒剂完全清除，故无噬菌体感染敏感细胞，敏感细胞菌苔上无噬菌斑出现。44质控

阳性对照≥20个噬菌斑

阴性对照≤10个噬菌斑结果判断标准标本

阳性结果≥20个噬菌斑

阴性结果≤19个噬菌斑阴性：无噬菌斑阳性：可数噬菌斑阳性：噬菌斑部分融合阳性：噬菌斑完全融合45适用范围可检测痰液、胸水、腹水、脑脊液、尿、骨髓等多种标本用于结核病的实验诊断抗痨治疗效果的评价※尤其是初诊病人的鉴别诊断※用于结核菌耐药性的快速检测用于HIV高危人群的鉴别诊断

FromEngland!46药敏试验47

M.tbbacillusSensorcellSensorcellSensorcellSensorcellSensorcell指示细胞指示细胞指示细胞指示细胞指示细胞l

室温5分钟37℃1小时18-24小时加入杀毒剂加入培养基和指示细胞药物＋细菌↓24-48小时加入噬菌体MTBMTB48RFP敏感株结果

无RIF含RIF49RFP耐药株结果

无RIF含RIF50上海市结核（肺）重点实验室

方法评价－优点快速：24～48小时比较灵敏：200～300条/ml检测活菌：相对定量：安全：51上海市结核（肺）重点实验室方法评价－缺点操作步骤多影响因素多有假阳性和假阴性

假阴性率10～88％假阳性率2～48％52上海市结核（肺）重点实验室假阳性和假阴性原因噬菌体的交叉感染－6种NTM检测结果阳性

（偶然、胞内、金色、丁酸、耻垢、草分枝）操作因素对结果的影响

53辅助诊断一、免疫学诊断方法二、血清学诊断三、酶学诊断54一、免疫学诊断方法PPD皮试，用于鉴别诊断有参考意义。T细胞亚群和一些细胞因子：CD3、CD4/CD8、IL-2(R)、干扰素、肿瘤坏死因子等检查，以了解细胞免疫状态，或作为考核指标前后对比。55二.血清学诊断－结核抗体检测(1)结明试验(MycoDot)，分枝杆菌细胞壁富含脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，为一种抗原，能诱发宿主产生相应抗体，激发迟发超敏反应，不提供保护性免疫。LAM-IgG有试剂盒供应，操作方便，敏感性70%左右，特异性90%左右，适用于菌阴肺结核病和肺外结核病；菌阴肺结核病如果证明试验阳性，示有活动性，可给予化疗。本法20分钟可出结果。(2)金免疫斑点渗滤试验(DIGFA，金标法)，用H37RvPPD-IgG作为抗原，产生与LAM-IgG同样结果，国产、价格较廉。(3)38KD蛋白质抗原，是主要免疫原，用以区别结核感染还是NTM感染，正在研究中。56测定方法：酶联免疫吸附试验（ELISA）免疫渗滤试验（DIGFA）免疫层析试验（DICA）57

假阳性率15～90％假阴性率5～65％58结核抗体检测临床应用1）辅助诊断结核病2）作鉴别诊断3）用于疗效观察4）在结核病流行病学调查中的应用5）作为器官移植并发结核感染的监测指标

59结核抗体检测优点：

简便、