夏小落的SOD制备方案课件

超氧化物歧化酶（SOD）的生产----夏小落任务1SOD制备方案的制定1一、概述超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)，作为一种专一清除生物体内超氧阴离子自由基(O2-)的酶，催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，减少超氧阴离子自由基对生物体的毒害。它是1968年由Mocord和Fmidovich发现的。此酶属金属酶，广泛存在于动植物、微生物细胞中。目前，人们已从动物、植物和微生物体内分离得到，并且通过多种方法应用到实际中，如应用到医药方面、食品、农业、化妆品及人和动植物许多疾病的监测方面等。2自由基引发的疾病

脑：老年痴呆、帕金森氏症、脑循环障碍

皮肤：异位性皮肤炎、色素沉着黑斑、老人斑、皮肤过敏

心血管：高血压、动脉硬化、心肌梗塞、心肌无力、心律不整

眼睛：白内障、退化性眼底病变，新生儿视网膜病变

呼吸系统：鼻子过敏、气喘、肺气肿、肺纤维化、成人呼吸窘迫症

泌尿系统：肾脏病、蛋白尿、膀胱炎、肾丝球发炎

其它：便秘、口臭、糖尿病及共并发症、风湿性关节炎、癌症、化疗副作用手术、器官移植、肝炎、更年期。3SOD平衡清除中和修复5SOD在各产业中的应用比例6SOD在食品中的应用比例最大抗炎症

抗衰老

滋养保健及美容

抗辐射

抗肿瘤

抗自身免疫性疾病

SOD7ＳＯＤ在医药上的应用治疗炎症

老年性白内障治疗心肌缺血与缺血再灌注综合症

治疗自身免疫性疾病

1238三、SOD的理化性质SOD是一种金属蛋白，因此它对热、对pH值在某些性质上表现出异常的稳定性。1、对热稳定性：构象熔点温度Tm的测定表明SOD是迄今发现稳定性最高的球蛋白之一。2、pH值对SOD的影响：SOD在pH=5.3-10.5范围内其催化速度不受影响。但pH=3.6是SOD中Zn要脱落95%；pH=12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变，从而导致酶活性丧失。3、吸收光谱：取决于酶蛋白和金属辅基，几乎所有的Cu，Zn-SOD的紫外吸收光谱的共同特点是在250-270nm均有不同程度的吸收，而在280nm的吸收将不存在或不明显。Cu，Zn-SOD的可见光吸收光谱反应二价铜离子的光学性质，不同来源的SOD都在680nm处附近呈现最大吸收。4、金属辅基与酶活性：Zn仅与酶分子结构有关，而与催化活性无关；Cu与催化活性有关（透析去除Cu则酶活性全部丧失）11四、SOD十大功效1，清除自由基，提高免疫力，改善睡眠，增强记忆力，延缓衰老

2，有效降低血脂，血压，胆固醇，血粘度，预防老年性痴呆

3，增强肝胆功能

4，预防老年性白内障，提高视力

5，对糖尿病有明显的辅助治疗作用

6，调节女性生理周期，推迟更年期，防治前列腺炎

7，提高关节活动能力，防治骨性关节炎，类风湿性关节炎

8，有效预防肿瘤，癌症的发生发展

9，防治黑色素的形成，美白祛斑，祛皱，祛痘

10，增强创伤愈合能力12二、仪器、试剂和材料1、研钵，石英砂，烧杯（50mL），玻璃棒，pH计，冷冻离心机，离心管。2、新鲜蒜瓣，市售。3、打碎细胞，通过细胞培养技术获得。4、磷酸缓冲液：0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液。5、氯仿-乙醇混合溶剂氯仿：无水乙醇=3:5（V:V）。6、丙酮用前冷却至4~10℃。7、碳酸盐缓冲液0.05mol/LpH10.2。8、EDTA溶液0.1mol/L。9、肾上腺素2mol/L（用于检测）14三、操作步骤基本步骤：

原料→清洗→破碎→浸提→热变性→高速冷冻离心→调整PH→高速冷冻离心→加丙酮沉淀→高速冷冻离心→溶解沉淀→透析→冷冻干燥→成品15三、操作步骤1组织或细胞破碎称取5g左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞,至于研磨器中研磨,使组织或细胞破碎。2、SOD的提取：

将上述破碎的组织或细胞，加入2-3倍体积的0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000r/min下，离心15min，弃沉淀，得提取液。16三、操作步骤3、除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合剂搅拌15min，5000r/min离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。17三、操作步骤

4、SOD的沉淀分离

将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,5000r/min离心15min,得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液中，于55-60℃热处理15min,离心弃沉淀，得到SOD酶液。18四、超氧化物歧化酶的检测

在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30℃水浴中预热5min至恒温。加入肾上腺素（空白管不加）继续保温2min，然后立即测定个管在480nm处的光密度。对照管与样品管的光密度值。酶活力（单位）=2x(A-B)x

N/AＮ———样品稀释倍数；２———抑制肾上腺素自氧化５０％的