《jjw细胞周期》课件

细胞周期

蒋建伟《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第1页!Chen（Chen,2009）提出联合使用黄芩素和水飞蓟素，对肝癌HepG2细胞显示良好的杀伤作用，对正常肝细胞（Changliver）活性没有影响，两种药物联合应用增加了G0/G1期细胞的百分率，减少了S期细胞的百分率，上调了Rb、p53、Cip1/p21和Kip1/p27蛋白，下调了CyclinD1、CyclinE、CDK4和phospho-Rb。ChenL,WillisSN,WeiA,etal.DifferentialtargetingofprosurvivalBcl-2proteinsbytheirBH3-onlyligandsallowsplementaryapoptoticfunction.MolCell,2005,17(3):393-403Varghese（Varghese,2005）采用肝癌HepG2和Hep3B细胞研究水飞蓟宾的抗肿瘤作用，发现水飞蓟宾强烈抑制HepG2和Hep3B细胞增殖，且对Hep3B细胞的增殖抑制效果更强。对于HepG2细胞，水飞蓟宾导致G1期阻滞；对于Hep3B细胞，导致G1和G2-M阻滞。对于这2种细胞，水飞蓟宾诱导Kip1/p27表达，减少cyclinD1、cyclinD3、cyclinE、CDK2和CDK4表达水平。VargheseL,AgarwalC,yagiA,SinghRP,AgarwalR.Silibininefficacyagainsthumanhepatocellularcarcinoma.ClinCancerRes,2005,23(11):8441-8448.《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第2页!PI单染流式细胞仪检测细胞周期百分比（n=3）组别G0/G1期S期G2/M期ControlRODN(1.0μmol/L)ASODN(0.75μmol/L)ASODN(1.0μmol/L)47.40±0.5048.30±0.3040.10±0.36**33.27±0.47**49.50±0.3048.60±0.3658.90±0.30**63.83±0.38**3.10±0.203.07±0.250.97±0.062.90±0.10注：**与RODN组相比，P<0.01《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第3页!细胞周期是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。G0《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第4页!G1→S→G2→M→G1周期性运转，在间期细胞体积增大(生长)，M期细胞先核分裂，接着胞质分裂，G1→S→G2→M→G1周期性运转，

在间期细胞体积增大(生长)，S期DNA复制，M期细胞先核分裂，接着胞质分裂，完成一个细胞周期。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第5页!特点：能对各种环境信号,进行综合协调，并作出反应，以确定是否进入S期。事件：细胞生长主要阶段。合成组蛋白、非组蛋白、一些酶类、一定量的RNA，还有微管蛋白和抑素。

这些蛋白即触发蛋白，积累到一定程度，可通过G1期检查点，进入S期。

抑素：与细胞停止在G1期有关。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第6页!特点：

(1)主要为DNA合成：开始时，急剧形成DNA聚合酶及4种脱氧核苷酸以后，合成DNA等。

S期细胞中有一种诱导物质，能促进DNA的合成。

Bao和Johnson，采用Hela细胞。把G1期细胞与S期细胞融合，引起G1期细胞核合成DNA。融合的S期细胞越多，G1期细胞合成DNA的速度越快。(2)S期的蛋白质合成：合成组蛋白和非组蛋白。DNA复制过程中需不断合成蛋白质，组蛋白的合成和DNA的复制密切配合。Gurlez和Hardin：（1）用药物阻断蛋白质合成（如加入环己酰胺），几秒钟后DNA合成停止。（2）用药物抑制DNA合成（如加入阿霉素），组蛋白合成立即停止，非组蛋白合成不受影响。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第7页!M期

时期：最终阶段基本特点：形态、结构变化最大，细胞增殖标志时间：短，较恒定分期：前期、中期、后期，末期

《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第8页!M期-中期要点:纺缍体及赤道板形成

特点:

纺缍体：已形成，稳定

染色体：高度浓缩，形成中期板(赤道板)细胞形状：圆形、易脱落《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第9页!M期末期要点:细胞质分裂，形成2个子细胞

特点胞质中重新出现正常结构，纺缍体消失。新的核膜形成，染色体解螺旋化形成染色质。胞质分裂cytokinesis：形成特殊临时性结构：收缩环，细胞膜内陷，生成2个子细胞。每个子细胞含有一套完整的染色体，细胞则完成一个周期，进入下一个间期。

《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第10页!典型的真核生物细胞周期都有2个特征：生长和细胞分裂。人迅速分裂的细胞经整个细胞周期要24h：G1:7h;S:10h;G2:4.5h;M:0.5h一些细胞可以暂时离开细胞周期，进入G0期，处于G0期的细胞不分裂，也不生长。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第11页!《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第12页!MPF的发现及其作用:MPF,即卵细胞促成熟因子(maturation-promotingfactor),或促细胞分裂因子(mitosis-promotingfactor),或M期促进因子(M

phase-promotingfactor).背景一:Rao和Johnson(1970、1972、1974)将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞在灭活仙台病毒介导下诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的染色体凝集，称之为染色体超前凝集(prematurelycondensedchromosome，PCC)。如图所示:《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第13页!人M期细胞与袋鼠的G1、S、G2期细胞融合诱导PCC：

同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生:PCC：染色体超前凝集《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第14页!因此，在成熟卵细胞的细胞质中必然有一种物质，可以诱导卵母细胞成熟，称之为促成熟因子，MPF。

MPF:卵细胞促成熟因子(maturation-promotingfactor),

《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第15页!Ⅱp34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系：另一批生物学家以酵母为材料，从另一个侧面对细胞周期调控进行着深入研究.如：L.Hartwell以芽殖酵母为实验材料；如：P.Nurse以裂殖酵母为实验材料。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第16页!很快Maller＋Nurse证明：MPF中的p34cdc28可以被p34cdc2特异抗体所识别，并且p34cdc2可以加速MPF活性，表明二者是同源物。p34cdc2与p34cdc28是同源物。（脊椎动物MPF的催化亚单位是CDK1，在裂殖酵母为CDC2，芽生酵母为CDC28。）进一步研究发现：p34cdc2或p34cdc28本身并不具有激酶活性，只有当其与有关蛋白结合后，其激酶活性才能够表现出来。例如：p34cdc2必须与另一种蛋白p56cdc13结合后才具有激酶活性。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第17页!CyclinB的性质P468实验：卵提取物影响精子染色质的周期改变。（1）加入未经处理的蟾蜍卵提取物，使精子染色质存在细胞周期事件；（2）加入RNA酶水解的卵提取物，使精子染色质的细胞周期消失。（3）当RNA酶处理卵提取物+野生型cyclinBmRNA，精子染色质的周期重现。（4）当加入RNA酶处理卵提取物加不能降解的cyclinBmRNA，精子染色质致密化，核膜溶解。但有丝分裂晚期事件染色体去致密化和核膜形成都不发生。说明：卵提取物中CyclinB对细胞周期必需。且：cyclinB降解对精子染色质的细胞周期结束是必需的。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第18页!由此MPF的生化成分得到确定：（催化亚单位）（调节亚单位）酵母的p56cdc13p34cdc28CDK1MPF=

p34cdc2+cyclinB《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第19页!MPF=

p34cdc2+cyclinB《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第20页!第二部分3.Cyclins-CDKs-CKIs调控网络

Cyclins-CDKs相互配合

Cyclins不同时相而出现CDKs不同时相而出现4.G1—S期转折5.G2—M期转折6.CKIs《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第21页!周期蛋白cyclins：自1983年首次发现周期蛋白后，许多科学家纷纷开展周期蛋白研究，短短10年就从各种生物中克隆分离了数十种周期蛋白，如酵母的Cln1、Cln2、Cln3、Clb1-Clb6，高等动物的周期蛋白A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等等。各种周期蛋白均含有100个左右的保守氨基酸序列，称为周期蛋白框，它可介导周期蛋白cyclins与CDK结合。

《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第22页!周期蛋白(A,B)分子的N端含有破坏框。Destructionbox的C端含lys残基，可结合多个泛素。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第23页!CyclinD，C，E等含有：PEST序列(一个富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、天冬氨酸（S）、丝氨酸和苏氨酸（T）残基的PEST序列，与泛素结合而降解。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第24页!CyclinD

CyclinECyclinACyclinBCDK4/6

CDK2CDK2CDK1G1--------→S-----→G2-→M---------G1

cdc2CyclinD《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第25页!Cyclins（细胞周期蛋白）对CDKs具有正性调控作用。CDKs（cyclin-dependentkinase，细胞周期蛋白依赖性激酶）是调控网络的核心。CKIs（CDKinhibitor，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子）具有负性调控作用。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第26页!CDK的分子量一般为35～40kD，不同CDK的氨基酸组成有40%以上的同源性。典型的CDK催化亚基的活性中心约由300个氨基酸残基组成，当处于单体或非磷酸化状态时，CDK没有催化活性。CDK含有一段保守氨基酸序列-PSTAIRE，与周期蛋白cyclins的结合有关。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第27页!CDK的催化活性受到激活因素与抑制因素两方面的调节。在激活因素中，目前认为CDK与周期素的结合以及保守的苏氨酸残基的磷酸化是较为重要的两种调节因素而在抑制因素中，CDK的N-端氨基酸残基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的结合是主要的调节因素。RegulationofCDKActivity《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第28页!磷酸化修饰的激活作用：CDK的激活还必须依赖于其保守的苏氨酸残基的磷酸化，如在人CDK1（p34cdc2）中的Thr161和CDK2中的Thr160的磷酸化，就与这两个酶的激活相关。催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK，该酶是一种寡聚体，其催化亚基为CDK7，调节亚基为周期素H。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第29页!催化Thr14和Tyr15磷酸化的是两种不同的蛋白激酶，使Thr14磷酸化的为蛋白激酶Wee1，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Myt1。催化Thr14和Tyr15脱磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。因此，蛋白激酶Wee1和Myt1及蛋白磷酸酶CDC25的相对活性，决定CDK1和CDK2的活性高低。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第30页!抑制蛋白的抑制作用：近年来，已分离并鉴定了若干能够与周期素-CDK复合物特异性结合并抑制其活性的蛋白因子，这些蛋白因子被称为周期素依赖性蛋白激酶抑制蛋白（CKI）。大部分CKI都是抑癌基因的编码产物。在哺乳动物细胞中，目前已经确定的CKI主要有：P21WAF1/CIP1、P27KIP1、P16INK4和P15INK4B，可分别抑制各型CDK的活性。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第31页!小结：Cyclins与CDKG1期CyclinD表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，然后释放出转录因子E2F，促进其他Cyclin和CDK的转录；在G1/S期，CyclinE与CDK2结合，促进细胞进入S期。进入S期后，CyclinE降解，CDK2转而与CyclinA结合，推进细胞进入G2期；在G2/M期，CyclinB合成并与CDK1结合，导致染色体凝缩，核膜解体等,促进细胞进入M期。在M期，激活后期促进复合物APC（anaphasepromotingplex），将泛素连接在CyclinB上，导致CyclinB被蛋白酶体降解、失活，结束M期。DEAB《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第32页!4.G1期到S期的转折，DNA的复制。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第33页!cyclinD首先在酵母菌中被发现，它能激活CDK6，它有3个亚型，包括D1、D2、D3，具组织特异性。周期素D的C-端存在一个PEST序列；N-端含有一个共同顺序Leu-X-Cys-X-Glu，是周期素D与p110Rb等蛋白结合所必需。

cyclinD1在G1中期合成达到高峰。

cyclinD1的功能主要是促进细胞增殖。CyclinD2峰值在G1晚期，给G1期细胞微量注射cyclinD2抗体，可使表达cyclinD2的淋巴细胞停滞在G1期。说明：

cyclinD2是细胞从G1期向S期转移所必须的。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第34页!cyclinE在cyclinD之后出现。

cyclinE基因及其产物的表达在细胞周期的G1中期上升，至G1晚期或S早期达高峰，在G1晚期发挥正调控细胞周期的作用。cyclinA：cyclinA在cyclinE之后很快表达。cyclinA是G1期向S期转移的限速因素。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第35页!Rb蛋白与E2F转录因子《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第36页!《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第37页!有丝分裂原刺激G0期细胞，促进CDK4/6,CyclinD,E2F的转录。CyclinD表达，并与CDK4/6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，然后释放出转录因子E2F。E2F促进E2F、CDK2，CyclinE，A表达。G1晚期，CDK2，CyclinE进一步磷酸化更多的Rb，释放更多的E2F，促进更多的E2F、CDK2，CyclinE，A表达，形成正反馈。CDK2-CyclinE和E2F相互正性调节。E2F的活化《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第38页!第二部分3.Cyclins-CDKs-CKIs调控网络

Cyclins-CDKs相互配合

Cyclins不同时相而出现CDKs不同时相而出现4.G1—S期转折5.G2—M期转折6.CKIs《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第39页!M期细胞周期蛋白（M-cyclin）在G2／M交界期诱导细胞分裂的cyclin。即在G2→M期转换处发挥作用，诱导细胞分裂的周期素，包括周期素A、B两种。这类蛋白在其N-端含有一个降解盒，在M期通过泛素（ubiquitin）途径降解。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第40页!cyclinA含量在S期及G2期初最高，cyclinB在G2期末含量最高；cyclinA与CDK2，CDK1结合，cyclinB与CDK1结合；cyclinA在S期发挥作用，与DNA的复制完成有关cyclinB在G2／M交界期发挥作用，诱发细胞分裂及细胞分裂进展。cyclinA、cyclinB的区别：《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第41页!《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第42页!6.CKIs可阻止细胞通过检验点，其作用方式是直接与CDK或cyclin-CDK复合物结合，已发现的CKI有p16家族和p21家族p16家族又称INK4家族（inhibitorsofkinase4）

P16,P15,P18,P19特异性抑制CDK4,CDK6P21家族又称CIP（CDKinhibitoryprotein）/KIP家族

P21,P27,P57抑制大多数

cyclins

活性。14-3-3《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第43页!2、p15INKb

p15位于9号染色体紧邻p16的区域，它与p16一样属抑癌基因。高甲基化引起p15灭活常见于白血病和淋巴瘤。P15抑制CDK4/6.调节（略）：c-Myc和Max、Miz1在p15启动子的起始部位形成复合物，抑制p15表达。

Miz1（mycinteractingzincfingerprotein1）能结合p15启动子的起始成分，增加p15的表达，引起细胞G1期阻滞，抑制CyclinD的激酶活性。c-Myc拮抗这一作用。TGF-β激活p15的表达；减少c-Myc的表达，解除c-Myc对Miz1的抑制作用，增加p15的转录。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第44页!CIP/

KIPs家族的CKIs：p21、P27、p57等，

《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第45页!P21/CIP1是由抑癌基因WAF1/CIP1编码合成的蛋白质，几乎能与所有的周期素-CDK复合物结合，抑制其蛋白激酶活性，启动子上有p53结合位点。P21表达导致G1期阻滞和G2/M期阻滞。激活p21：P53转录激活p21.钙调蛋白促进p21核转移。抑制p21（略）

：

C-Myc抑制p21Set通过结合p21，解除p21对CDK2/CyclinE的抑制。Her2激活Akt，Akt结合和磷酸化p21，阻滞p21向核内转位。Her2激活Akt，Akt抑制Fox01/3，Fox01/3转录激活p21，p27。Her2间接抑制p21，p27。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第46页!14-3-3δP53诱导14-3-3δ表达，14-3-3δ结合CDK1，并将之输出胞核，抑制CDK1与cyclinB的结合。抑制细胞进入M期，使细胞有更多的时间进行DNA修复。14-3-3δ蛋白可以直接提高P53的转录活性，形成一个正反馈环。14-3-3可结合cdc25，并将之输出胞核，抑制CDK1-cyclinB的作用，诱导G2期阻滞，使细胞周期停滞而进一步启动损伤修复机制。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第47页!第三部分

7.细胞周期调节的关卡checkpoint

（1）G1和G2期阻滞

G1期关卡：G1期关卡反应的二重波模型G2期关卡：G2期关卡反应的二重波模型

（2）S期关卡（3）有丝分裂纺锤体关卡(spindleassemblycheckpoint，SAC)

8.

细胞周期调控异常与肿瘤9.细胞周期调控的抗肿瘤药物《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第48页!主要检验点包括:G1/S检验点，S期检验点，G2/M检验点，纺锤体组装检验点(spindleassemblycheckpoint，SAC）。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第49页!一、G1和G2期阻滞当紫外线、γ射线或化学修饰使DNA受到损伤，细胞停滞在G1和G2期，直到损伤得到修复。P53可使受损的DNA停滞在G1期或G2期。损伤的DNA使p53稳定，浓度增加，激活p21，p21与CDK2-cyclinE、CDC2-cyclinB结合，使细胞停滞在G1或G2期。p53促进puma、Noxa，Bax的表达，促进细胞凋亡。G1期关卡反应的二重波模型（twowavemodel）一开始迅速短暂的p53非依赖的反应，导致细胞周期停滞，接着延缓的持续的p53-p21轴引起G1期停滞《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第50页!二重波模型

其次：延缓持续的p53-p21轴引起G1期停滞。

DNA损伤，ATM/ATR活化，促进p53磷酸化活化；或促进Chk1磷酸化，进而磷酸化p53。或促进Chk2磷酸化，进而磷酸化p53；并解除MDM、MDM2对p53的抑制，使p53游离。另外ATM磷酸化MDM2，磷酸化p53，抑制p53向胞外输出，促进p53在核内发挥作用。

p53转录激活p21，p21结合cyclinE-CDK2，抑制其活性，促进G1期停滞。另外，IR促进cyclinD1的泛素化降解，使p21-cyclinD1-CDK4复合物解离，p21转而结合cyclinE-CDK2，抑制其活性，细胞停滞于G1期。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第51页!P53与G2期停滞：二重波理论同样适用于G2期阻滞。首先：DNA损伤，ATM/ATR活化，Chk1，Chk2活化，抑制Cdc25活性，解除cdc25对cyclinB-CDK1的活化，细胞周期停滞。其次：ATM/ATR活化，促进p53活化。P53促进p21转录，p21抑制cyclinB-CDK1活性，使细胞停滞于G2期。P53促进GADD45转录，抑制cyclinB-CDK1活性。P53诱导14-3-3δ表达，14-3-3δ结合CDK1，并将之输出胞核，抑制CDK1与cyclinB的结合。抑制细胞进入M期，使细胞有更多的时间进行DNA修复。14-3-3δ蛋白可以直接提高P53的转录活性，形成一个正反馈环。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第52页!二、S期关卡

抑制DNA的合成，使S期延长，而不是永久的停滞。S期关卡是短暂现象，在此期间，p53，p21并无特殊的作用。IR----DNA断裂----ATM活化----磷酸化Chk2---促进Cdc25A磷酸化，并泛素化降解---导致s期延迟。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第53页!第三部分

7.细胞周期调节的关卡checkpoint

（1）G1和G2期阻滞

G1期关卡：G1期关卡反应的二重波模型G2期关卡：G2期关卡反应的二重波模型

（2）S期关卡（3）有丝分裂纺锤体关卡(spindleassemblycheckpoint，SAC)

8.

细胞周期调控异常与肿瘤9.细胞周期调控的抗肿瘤药物《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第54页!（2）G1/S期转折关卡和癌症抑癌基因突变：

ATM,ATR,Chk1,Chk2,Brcal,P53,P16,Rb癌基因过度表达：

Cdc25A，cyclinD1，cyclinE《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第55页!（4）p53和14-3-3δP53在调节对DNA损伤反应，保持DNA稳定非常重要。在大约半数人类肿瘤，存在p53功能丢失。另外半数癌症的缺陷不清，可能是p53通路的不同位点被灭活，也可能是p53非依赖的调节机制有缺陷。DNA损伤，p53活化，诱导14-3-3δ表达。P53调节14-3-3δ维持基因组的稳定。在部分非p53突变的癌症中，存在14-3-3δ表达异常。在乳腺癌细胞、胃癌、肝癌细胞中14-3-3δ的CpG岛高甲基化和转录沉默。在乳腺癌细胞，头颈鳞状细胞癌，原发性膀胱癌中，14-3-3δ表达下降。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第56页!TheEnd《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第57页!Chen（Chen,2009）提出联合使用黄芩素和水飞蓟素，对肝癌HepG2细胞显示良好的杀伤作用，对正常肝细胞（Changliver）活性没有影响，两种药物联合应用增加了G0/G1期细胞的百分率，减少了S期细胞的百分率，上调了Rb、p53、Cip1/p21和Kip1/p27蛋白，下调了CyclinD1、CyclinE、CDK4和phospho-Rb。ChenL,WillisSN,WeiA,etal.DifferentialtargetingofprosurvivalBcl-2proteinsbytheirBH3-onlyligandsallowsplementaryapoptoticfunction.MolCell,2005,17(3):393-403Varghese（Varghese,2005）采用肝癌HepG2和Hep3B细胞研究水飞蓟宾的抗肿瘤作用，发现水飞蓟宾强烈抑制HepG2和Hep3B细胞增殖，且对Hep3B细胞的增殖抑制效果更强。对于HepG2细胞，水飞蓟宾导致G1期阻滞；对于Hep3B细胞，导致G1和G2-M阻滞。对于这2种细胞，水飞蓟宾诱导Kip1/p27表达，减少cyclinD1、cyclinD3、cyclinE、CDK2和CDK4表达水平。VargheseL,AgarwalC,yagiA,SinghRP,AgarwalR.Silibininefficacyagainsthumanhepatocellularcarcinoma.ClinCancerRes,2005,23(11):8441-8448.《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第58页!部分：细胞周期概况：间期：G0，G1，S，G2

分裂期：M2.实验发现一些蛋白和激酶调控细胞周期《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第59页!细胞周期与DNA合成正常的细胞周期分为间期（interphase）和有丝分裂期(Mphase)。其中间期

以DNA合成为标志。分为：G0期（即静止状态），G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期）G2期（合成其它必需的物质）《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第60页!G1期

时期:从有丝分裂结束到DNA合成开始之间。FirstGap有丝分裂后期,子细胞继续生长时期。时间:变化大,几小时---几天

人体200多种细胞，周期时间不同,主要在G1。

如：胚胎早期卵裂细胞几乎测不到G1期淋巴细胞数小时神经元细胞终生停在G1期《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第61页!S期DNA合成期基本特点：（1）复制DNA，为分裂作准备（2）合成组蛋白和非组蛋白。时间：约10h左右形态：细胞增大S期末，DNA加倍。完成DNA复制，才能入M期。

《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第62页!G2期

时期:分裂之前

时间：较短，约2-3h

多数细胞休止于G1期，也有细胞休止于G2期，如少数休眠的种子细胞。特点：主要合成分裂有关的蛋白质，尤以细胞骨架蛋白。

如阻止蛋白质合成，细胞不进入分裂。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第63页!前期prophase染色质凝集，核膜崩解，纺缍体形成特点：1.染色体组装：染色质疑集，M期开始。分裂前染色质逐渐变短，变粗，成染色体，每个复制的染色体形成一对姐妹染色体（sisterchromatics）。2.纺缍体形成：中心粒:2套中心粒分离,向两极移动成为纺缍体的两个极，是微管组织中心(MTOC)。3.核膜破裂，前期结束。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第64页!M期后期要点:后期开始染色单体分离，分别移动到相反的纺锤体极。

细胞形状：略变长。

《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第65页!M期细胞的有丝分裂《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第66页!0h4h12h20h《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第67页!部分：细胞周期概况：

间期：G0，G1，S，G2

分裂期：M2.实验发现一些蛋白和激酶调控细胞周期

MPF的发现：PCC：prematurelycondensedchromosome染色体超前凝集MFP：mitosis-promotingfactors细胞促分裂因子APC：anaphagepromotingplex细胞分裂后期促进复合物《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第68页!G1期PCC为单线状，因DNA未复制;S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制G2期PCC为双线染色体DNA复制已完成PCC：染色体超前凝集这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，称为细胞促分裂因子mitosis-promotingfactor

。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第69页!MPF,即卵细胞促成熟因子(maturation-promotingfactor),或促细胞分裂因子(mitosis-promotingfactor),背景二：1971年,Masui和Markert用非洲爪蟾做实验，明确提出了MPF这一概念。非洲爪蟾卵母细胞在其卵巢里发育，它们复制DNA，然后在G2期停滞8个月。受到雄性刺激后，卵巢细胞分泌孕酮，刺激G2期细胞进行次减数分裂和第二次减数分裂，停滞在第二次减数分裂中期，称为卵子（egg）。实验：（1）取一个G2期的卵母细胞，孕酮处理，诱导它成熟为卵细胞。（2）利用一微针头将停滞在第二次减数分裂中期的卵细胞的胞浆5%转移到另一个处于G2停滞期的卵母细胞，促进这个卵母细胞发育成熟。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第70页!分离纯化出MPF：直到1988年，Maller实验室的Lohka等人才以非洲爪蟾为材料，分离得到了微克级的纯化的MPF。证明其含有p32和p45两种蛋白。二者结合后表现出蛋白激酶活性，可以使多种蛋白质底物磷酸化。证明，MPF是一种蛋白激酶。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第71页!P.Nurse在裂殖酵母中发现的cdc2基因就是个被分离出来的cdc基因。其表达产物是一种相对分子量为34×103的蛋白，被称为p34cdc2。进一步研究发现，p34cdc2具有激酶活性，可使多种蛋白底物磷酸化，在裂殖酵母周期调控中起关键性调节作用。

L.Hartwell在芽殖酵母中发现的cdc28基因是第二个被分离出的cdc基因，其表达产物也是一种相对分子量为34×103的蛋白，被称为p34cdc28。它也是一种蛋白激酶，在G2/M转换过程中起中心调节作用。这些与细胞分裂和周期调控有关的基因被称为(celldivisioncycle)cdc基因，根据被发现的先后顺序被命名。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第72页!在研究酵母的同时，以TimHunt为代表的另一批科学家正在以海胆卵为材料，对细胞周期调控进行着深入研究。他们发现：有两种蛋白质的含量随细胞周期进程的变化而变化，一般在细胞间期内积累，在细胞分裂期内消失，在下一个周期中又重复这一消长现象。因此称这两种蛋白为细胞周期蛋白(cyclin)。并很快被分离和克隆出来，证明其广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中，而且在功能上存在互补性。Maller＋Hunt合作证明：MPF中的另一种成分是周期蛋白B。序列分析证明，周期蛋白B与酵母的p56cdc13是同源物。周期蛋白B:CyclinB《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第73页!CyclinB的降解：CyclinB的N端含有destructionbox，C端有Lys残基。结合泛素。泛素：E1泛素激活酶：uniquitin-activatingenzyme

E2泛素结合酶:ubiquitin-conjugatingenzyme

E3泛素连接酶：ubiquitinligase细胞分裂后期促进复合物（anaphasepromotingplex,APC）MPF(CDC2+cyclinB)活性在分裂中期达到高峰。激活APC，cyclinB多泛素化，导致cyclinB降解，使MPF失活，进入下一个周期。CyclinB在细胞周期中连续合成，但是在有丝分裂的间期活性升高，在有丝分裂晚期突然下降。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第74页!2001年10月8日美国人Leland

Hartwell、英国人PaulNurse、Timothy

Hunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第75页!细胞周期调控的主要分子机制细胞周期的内源性调控主要是通过“Cyclins-CDKs-CKIs”这一调控网络。细胞周期内源性调控Cyclins–CDKs-CKIs正性调控核心负性调控CDKs（cyclin-dependentkinase）CKIs（CDKinhibitor）《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第76页!3.Cyclins-CDKs-CKIs调控网络Cyclins（细胞周期蛋白）对CDKs具有正性调控作用CDKs（cyclin-dependentkinase，细胞周期蛋白依赖性激酶）是调控网络的核心CKIs（CDKinhibitor，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子）具有负性调控作用。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第77页!部分周期蛋白分子结构特征图中除Cln3外，均为人的周期蛋白分子。所有这些分子均含有一个周期蛋白框，结合CDK

。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第78页!细胞周期蛋白的破坏框与降解途径《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第79页!各种细胞周期蛋白随特定细胞时相而出现。

G1早期，cyclinD表达并与CDK4或CDK6结合，成为始动细胞周期的启动子；

G1晚期、进入S早期后cyclinE表达，并与CDK2结合，推动细胞进入S期；进入S期后，cyclinA表达，并与CDK2结合，cyclinD、cyclinE降解；

S晚期、G2早期，cyclinA表达，cyclinB表达，并与cdc2结合，促进细胞进入M期。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第80页!《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第81页!CDK人们对CDK的认识，最初是通过研究培养细胞和酵母细胞而得到的。目前已经确定的CDK有：裂殖酵母中CdC2；酿酒酵母中的CdC28、PHO85、KIN28以及人类细胞中CDK1～10。是一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要生物学作用是促进细胞周期时相转变、推进细胞周期运行，CDK和其调节因子又被称作细胞周期引擎。异常可能导致肿瘤的发生。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第82页!《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第83页!周期素的激活作用：周期素中的“周期素盒”结构域直接和CDK的结合，并与CDK的激活相关，周期素是CDK的正性调节剂。周期素的这两种功能是密切相关的，而这种结合与激活作用主要通过周期素在细胞周期中的浓度波动来调控。ActivationofCDK《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第84页!磷酸化修饰的抑制作用：在人的CDK1和CDK2中，Thr14和Tyr15残基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。其原因在于上述残基的侧链位于该酶活性中心ATP结合部位的顶端，因而对激酶的磷酸化作用产生了阻碍。InhibitionofCDK《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第85页!RegulationofCDKActivity《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第86页!cdc2《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第87页!第二部分3.Cyclins-CDKs-CKIs调控网络

Cyclins-CDKs相互配合

Cyclins不同时相而出现CDKs不同时相而出现4.G1—S期转折5.G2—M期转折6.CKIs《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第88页!（一）G1期胞周期蛋白（G1-cyclin）作用在G1期或G1/S交界期，启动细胞周期和促进DNA合成的cyclin，G1期是增殖细胞唯一能接受从外界传入的增殖或抑制增殖信号的时期。cyclinD：cyclinD1，cyclinD2，cyclinD3cyclinCcyclinE：cyclinE1，cyclinE2CyclinA《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第89页!不同亚型周期素D在细胞内的表达模式不同，但主要是在G1期处于较高的表达水平。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第90页!G1期到S期的转折总的过程：G1期，在生长因子的刺激下，cyclinD表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1、c-Myc、PCNA、H2A的基因。E2F，myc共同激活cyclinE表达。CyclinE在晚G1期达到高峰，cyclinE激活CDK2，促进细胞进入S期。启动DNA复制。进入S期后，cyclinE降解。在G1晚期，cyclinA表达，并与CDK2结合。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第91页!Rb基因

Rb是CDK4/6-CyclinD，CDK2-CyclinE的底物。Rb基因位于人类染色体13q14，其转录产物Rb蛋白在细胞周期中起制动器功能。它能与转录因子E2F结合并阻止相应基因转录表达，从而抑制细胞生长。

Rb(p110),Rb相关蛋白p107，p130抑制E2F的转录活性。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第92页!细胞转录因子（E2F）在许多DNA合成基因和细胞生长调控基因的启动子中均含有E2F的位点，E2F可以直接活化这些基因，启动DNA合成使细胞进入S期。在E2F基因活化转录功能区内有一段18个氨基酸的序列可与Rb结合，Rb通过与E2F功能区的结合遮盖E2F功能区，抑制E2F转录功能，抑制DNA合成。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第93页!G1期CyclinD表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，然后释放出转录因子E2F，促进其他Cyclin和CDK的转录；在G1/S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞进入S期。进入S期后，CyclinE降解，CDK2转而与CyclinA结合，推进细胞进入G2期；小结：《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第94页!5.G2/M转折和有丝分裂的调控《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第95页!1、cyclinA：cyclinA在cyclinE之后很快表达。cyclinA是G1期向S期转移的限速因素，也可促进细胞从G2期向M期的转化。2、cyclinB：哺乳动物cyclinB在S晚期合成，在G2期浓度升高，在M早期达到最高。能促进G2期向M期的过渡。

cyclinA、cyclinB在M期通过泛素途径降解，这是细胞脱离有丝分裂所必须。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第96页!在G2/M期，CyclinB合成并与CDK1结合，作用于核纤层蛋白（lamins）、驱动蛋白（kinesin），参与DNA致密化的蛋白，泛素依赖的蛋白降解系统等，导致染色体凝缩，核膜解体等,促进细胞进入M期。CDK1的活化：当ATP结合部位14thr和15Tyr磷酸化，抑制。但14thr和15tyr去磷酸化，活化。CDC25活化CDK1-CyclinB，CDK1-CyclinB活化PLK1，PLK1活化CDC25，形成正反馈。Wee1、Myt1抑制CDK1-CyclinB。CDK1-CyclinB活化PLK1，Wee1抑制CDK1-CyclinB，PLK1抑制Weel。CDC25被chk1，chk2抑制，也可因结合14-3-3而失活。DNA损伤，chk1，chk2活化，抑制CDC25，阻碍CDK1-CyclinB，抑制细胞进入M期。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第97页!第二部分3.Cyclins-CDKs-CKIs调控网络

Cyclins-CDKs相互配合

Cyclins不同时相而出现CDKs不同时相而出现4.G1—S期转折5.G2—M期转折6.CKIs《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第98页!INK4家族的CKIINK家族的CKI包括p16(INK4a),p15(INK4b),p18(INK4c),P19(INK4d)INK4家族的蛋白识别CDK4和CDK6，但不识别CDK2，通过与CyclinD竞争结合CDK4而引起G1期停滞。1、p16(INK4a)

p16INK4是CDK4的特异性抑制物，可与CDK4或CDK6的结合，抑制cyclinD-CDK4/6复合物的作用，竞争抑制CDK4对细胞生长分裂的正向作用，参与抑制细胞周期G1／S的转化。

p16启动子甲基化是该基因沉默的主要机制。《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第99页!复制衰老《jjw细胞周期》课件共114页，您现在浏览的是第100页!P27/KIP1是由抑癌基因KIP1编码合成的蛋白质，P27抑制CDK2-CyclinE活性，阻滞细胞与G1期。激活p27（略）：PTEN增加p27的表达，抑制p27的泛素化，提高其稳定性。Forkhead转录因子（Afx，Fkhr）激活p27的转录。抑制p27（略）

：p27启动子甲基化c-Myc阻碍p27与CDK2-CyclinE的结合，间接抑制p27。Her2激活Akt，Akt结合和磷酸化p27，阻滞p27向核内转位。Her2激活Akt，Akt抑制Fox01/3，Fox01/3转录激活p21，p27。Her2间接抑制p21，p27。《jjw细胞