芳胺类药物分析课件

第七章芳香胺类药物的分析

芳胺类，苯乙胺类，苯丙胺类等药物分析【大纲要求】

一、掌握典型药物普鲁卡因、对乙酰氨基酚、肾上腺素、马来酸依那普利等及其制剂的鉴别反应、杂质检查和含量测定方法。二、熟悉本类药物的基本化学结构与特点。第一节芳胺类药物的分析芳胺类药物分为两类芳伯氨基未被取代芳伯氨基被酰化一、对氨基苯甲酸酯类药物的基本结构与主要化学性质（一）基本结构与典型药物苯佐卡因盐酸普鲁卡因1.芳伯氨基特性：重氮化－偶合反应；芳醛缩合成Schiff碱；易氧化变色等。盐酸丁卡因无此特性。（二）主要理化性质水解特性：分子结构中的酯键或酰胺键易水解，除盐酸丁卡因外水产物为对丁基苯甲酸外，上述均为对氨基苯甲酸。弱碱性：除苯佐卡因外，其余均含有叔胺氮的侧链，故具有弱碱性。4.其它特性：因结构中有芳伯氨基或同时具有脂烃胺侧链，其游离碱多为碱型油状液体或低熔点固体，难溶于水，可溶于有机溶剂。其盐酸盐则易溶于水。二、酰胺类药物的基本结构与主要化学性质（一）基本结构与典型药物对乙酰氨基酚（扑热息痛）醋氨苯砜盐酸布比卡因盐酸利多卡因3.酚羟基特性：对乙酰基酚有游离酚羟基；醋氨苯砜酸水解有酚羟基，可与FeCl3发生显色反应，可相互区别。4.弱碱性：利多卡因和布比卡因烃胺侧链有叔胺氮，显碱性，可与生物碱沉淀剂发生沉淀反应，可相互区别。5.与金属离子发生沉淀反应：利多卡因和布比卡因酰氨基上氮可与Cu2+,Co2+生成有色配位化合物沉淀。

直接反应：苯佐卡因、盐酸普鲁卡因、盐酸普鲁卡因胺间接反应：对乙酰氨基酚、醋氨苯砜利多卡因和布比卡因由于空间位阻很难发生此反应。

丁卡因虽无芳伯氨基，但可与NaNO2反应生成N－亚硝基化合物的乳白色沉淀。

（二）与三氯化铁反应对乙酰氨基酚+FeCl3蓝紫色化合物

1.与铜和钴离子反应：

利多卡因与硫酸铜生成蓝紫色配位化合物；与氯化钴生成亮绿色沉淀。（三）与金属离子反应2.羟肟酸铁盐反应

基于普鲁卡因胺分子中的芳酰胺结构。3.与汞离子反应盐酸利多卡因+H2NO3+Hg(NO3)2黄色对氨基苯甲酸酯＋H2NO3+Hg(NO3)2红色或橙黄色1.盐酸普鲁卡因的鉴别

(四)水解产物反应盐酸普鲁卡因+NaOH普鲁卡因油状物对氨基苯甲酸钠+二乙氨基乙醇（使湿润的红色石蕊试纸变兰色）对氨基苯甲酸钠+HCl对氨基苯甲酸（白色）2.苯佐卡因的鉴别

苯佐卡因+NaOH乙醇乙醇+I2

+NaOHCHI3（碘仿臭气，黄色沉淀）(五)制备衍生物测熔点1.三硝基苯酚衍生物的制备：利多卡因和布比卡因(六)紫外特征吸收光谱法

1.在λmax处测定供试液的百分吸收系数

例如：对乙酰基酚在0.4%NaOH中于λmax=240nm;E1%1cm=715在HCl(0.1nol/L)-甲醇于λmax=249nm;E1%1cm=8802.在规定的浓度2下测定λmax

例如：醋氨苯砜5μg/ml;λmax=256nm;284nm

再例如：盐酸普鲁卡因胺5μg/ml;λmax=280nm(七)红外吸收光谱法利用化合物结构中特殊基团的振动和转动等红外活性振动产生的红外吸收峰对药物进行鉴别的方法。要求能够对IR图中的cm-1（σ）进行正确的归属。2.有关物质检查：Ch.P是以对氯苯乙酰胺为对照品，采用TLC法中的杂质对照品法。3.对氨基酚检查：利用对氨基酚在碱性条件下可与亚硝基铁氰化钠生成蓝色配位化合物，采用比色法。(二)盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸的检查为什么要检查？怎样检查？采用TLC法中的杂质对照品法进行检查。（三）盐酸氯普卡因注射液中有关物质和光解产物的检查

由于盐酸氯普卡因注射液在生产和贮藏过程中会产生4-氨基-2-氯苯甲酸，影响疗效和成品的颜色，故此需要对降解产物进行检查1、高效液相色谱法（HPLC）2、液相色谱与质谱联用法（LC-MS）MSLCLC-MSLC-MS/MSLC-ESI-MS/MSLC-APCI-MS/MSLC-ESI-TOF-MS/MSLC-MALDI-TOF-MS/MSAgillent

安捷伦Waters

沃特斯Bruker

布鲁克Varian

瓦里安AB

美国应用生物系统Shimadzu

岛津Finnigan

菲尼根GITC（一）亚硝酸钠滴定法

Ar-NH2、Ar-NHCOR、Ar-NO2均可采用此法

Ch.P中的苯佐卡因、盐酸普鲁卡因和盐酸普鲁卡因胺及其制剂可直接采用本法、醋氨苯砜及注射液水解后用本法。五、含量测定1.原理：Ar-NHCOR+H2OAr-NH2+RCOOHH+Ar-NH2+NaNO2+2HClAr-N2+Cl-+NaCl+2H2O测定主要条件：(1)加KBr增加反应速度HBr>HCl>HNO3重氮化的反应历程为：NaNO2+HClHNO2+NaClHNO2+HClNOCl+H2OKHClKBr+HClHBr+KClHNO2+HClNOBr+H2OKKBr∵

KHBr比KHCl大300倍∴生成NOBr量大得多∴加快反应速度

(2)加过量HCl加速反应：

①重氮化速度加快；

②重氮盐在酸性介质中稳定；

③防止生成氨基偶氮化合物。

Ar-N2+Cl-+H2N-Ar

Ar-N=N-NH-Ar+HCl

一般摩尔比为Ar-NH2:HCl=1:2.5~6。(3)室温条件下滴定:温度高反应速度快；每升高10℃加快2.5倍太高,可使Ar-N2+Cl-+H2OAr-OH+N2+HCl(4)滴定管尖端插入液面下滴定

3.指示终点的方法

(1)用停滴定法

溶液检流计

终点前：

无过量无电流

HNO2

终点时：有过量有电流（使指针偏离零

HNO2永停在某一位置）

(2)外指示剂法

用KI-淀粉指示剂指示终点的原理：

2NaO2+2KI+4HCl

2NO+I2+2KCl+2NaCl+2H2OGVVR1R2+V(二）非水溶液滴定法

基于盐酸丁卡因、盐酸利多卡因和盐酸布比卡因侧链叔胺氮在滴定盐酸丁卡因时，因其在冰醋酸中碱性弱，加醋酐可增加其碱性。因醋酐合乙酰氧离子比醋酸和质子的酸性强，可增加碱性。2(CH3CO)2O(CH3CO)3O++CH3COO-相当于［B]HCl+Hg(Ac)2[B]HAc+HgCl2[B]HAc+HClO4[B]HClO4+HAc

1.对乙酰基酚原料的含量测定

在0.4%NaOH介质中，257nm

D%＝［E1%1cm]样／［E1%1cm]标×100％；E1%1cm＝715

2.对乙酰基酚片溶出度测定（测定条件同上）

1片＋稀HCl24ml+H2O1000ml精密量取5ml+0.4%NaOH10ml+H2O100mlλ257nm测定A。W×1／1000×5／100×100＝C（g/100ml)

W(g)=200×C;C=A/715∴溶出度＝W／标示量×100％＞80％为合格（三）分光光度法中性条件下的重氮化反应（四）比色法盐酸普鲁卡因+1,2-蒽醌-4-磺酸钠pH4-9棕红色化合物，max482nm处测定A等吸收双波长分光光度法测定盐酸普鲁卡因注射液的含量（五）盐酸普鲁卡因胺的快速荧光测定λex400nm（激发波长）、λem485nm（发射波长）处测定荧光强度，标准曲线法定量。盐酸普鲁卡因胺+荧胺pH7.5荧光物

此法主要用于盐酸普鲁卡因注射液的测定。因该注射液中常含有降解产物对氨基苯甲酸；可以苯甲酸为内标同时测定两者的含量，该法简单准确。色谱条件：色谱柱为ODS

流动相为甲醇－1％HAc(40:60)UV检测器250nm

（六）HPLC法返回第二节苯乙胺类药物的分析一、苯乙胺类药物的基本结构与主要化学性质（一）基本结构与典型药物*常见的苯乙胺类药物

（二）主要化学性质

1.弱碱性本类药物结构中有烃氨基侧链，为仲胺氮显弱碱性。

2.酚羟基特性本类药物结构中有酚羟基，可与FeCl3;发生氧化。

3.光学活性多数药物结构中有手性碳原子，具有旋光性。二、鉴别试验(一)与三氯化铁反应Ar-OH＋FeCl3络合显色＋碱液紫色或紫红色。

(二）甲醛－硫酸反应

在此试剂中形成醌式结构而显色。

药物

三氯化铁

甲醛－硫酸

肾上腺素0.1mol/LHCl显绿色,甲氨试液显红－紫红红色重酒石酸去甲肾上腺素绿色,加NaCO3试液显紫色－红色淡红色盐酸去氧肾上腺素紫色玫瑰红橙红棕红盐酸异丙肾上腺素深绿色,加5％NaCO3试液显蓝紫色－红色棕色暗紫色(三）氧化反应

本类药物具有Ar-OH，易被氧化剂I2,H2O2,K3Fe(CN)6氧化而显色，例如：肾上腺素在中性或酸性条件下，被I2,H2O2

氧化后，生成肾上腺素红；盐酸异丙肾上腺素在酸性条件下，被I2氧化，生成异丙肾上腺素红。(四）紫外特征吸收与红外吸收光谱例如：

盐酸异丙肾上腺素0.05mg/mlλmax=280nmA=0.50这一类药物均可采用红外吸收光谱进行鉴别(五）与亚硝基铁氰化钠(Rimini试验）是鉴别脂肪伯氨基的特殊反应，可用于重酒石酸间羟胺鉴别。D＋亚硝基铁氰化钠＋丙酮＋Na2CO3红紫色(六)双缩脲反应

是鉴别芳环氨基醇的特殊反应；可用于盐酸麻黄碱，盐酸伪麻黄碱鉴别：D＋CuSO4+NaOH显蓝紫色＋乙醚，醚层(紫红色)水层(蓝色)

(一)酮体检查

本类药物在生产过程中多采用酮体氢化制得，若氢化不完全，易引入酮体杂质。

采用UV法检查：

利用酮体在310nm有吸收，本类药物无吸收。例如：肾上腺素本项检查配2.0mg/mlλ=310nmA≤0.05

盐酸去氧肾上腺素配2.0mg/mlλ=310nmA≤0.02盐酸异丙肾上腺素配2.0mg/mlλ=310nmA≤0.15

三、特殊杂质检查(二)有关物质的检查盐酸去氧肾上腺素、硫酸沙丁胺醇－TLC盐酸苯乙双胍-PC

盐酸氨溴索－HPLC采用TLC法中的高低浓度对比法进行检查。

盐酸氨溴索的检查方法对照样品制备：本品→供试品溶液→对照溶液供试样品制备：本品→甲醇溶解→加甲醛溶液→加热→吹干溶剂→用水和流动相溶解→HPLC分析色谱条件：RP-HPLC0.01mol/lNH4H2PO4-CH3CN(50:50);248nm分析：对照溶液主成分峰为满量程的20％~25%，记录至主成分峰保留时间的2倍，注入供试品溶液，如有杂峰，各杂峰的面积之和不得大于对照液主峰面积的三分之一。(三)盐酸苯乙双胍中有关双胍的检查－PC法样品制备：本品甲醇溶解即得展开：7.5×50cm，EtOAc-ethanol-water(6:3:1)显色：10％铁氰化钾＋10％亚硝基铁氰化钠＋10％NaOH检测：剪下显色斑点后甲醇萃取用UV法测定

(一)非水溶液滴定法

本类药物的原料药多采用此法。

1.重酒石酸去甲肾上腺素的测定

相当于［B］的有机酸盐可直接滴定。

2.盐酸克仑特罗的测定

相当于［B］的HX酸盐不能直接滴定，需加Hg(Ac)2处理后滴定。

3.硫酸沙丁醇的测定

相当于［B］的H2SO4盐可直接滴定,也可处理后滴定。四、含量测定(二)溴量法本类药物重酒石酸间羟胺、盐酸去氧肾上腺素及其注射液用此法。基本原理：基本操作：供试品→精密称定→加水溶解后精密加溴滴定液＋盐酸→放置并振摇→加碘化钾→振摇→用Na2S2O3滴定至近终点→加淀粉指示液→继续滴定至蓝色消失同时进行空白实验（三）提取酸碱滴定法基本原理：药物的盐酸盐或硫酸盐易溶于水，而药物本身不溶于水，加适量碱化试剂后，用适当的有机溶剂萃取，提取也蒸干后用中性乙醇溶解，用标准酸液直接滴定，或加入滴定过量的标准酸溶液，用标准碱溶液进行回滴。硫酸苯丙胺的含量测定：［B］H2SO4+NaOH+NaCl乙醚提取［B］+H2SO4蒸去乙醚NaOH标准液滴定终点(四)紫外分光光度法与比色法

利用药物分子结构中的芳伯氨基进行重氮化－偶合反应，以及分子结构中的Ar-OH与Fe3＋络合显色，进行比色测定。盐酸异丙肾上腺素注射液重酒石酸间羟胺注射液盐酸甲氧明注射液硫酸沙丁胺醇注射液及胶囊例如：盐酸克伦特罗栓的含量测定

上述偶合剂可与HNO2显色，干扰比色测定，可先加氨基磺酸铵分解过量的HNO2。HNO2＋2H2NSO3NH42N2+(NH4)2SO4+H2SO4+H2O(五)荧光分光光度法肾上腺素测定：λex410nm、λem520nm处测定荧光强度，对照法定量。肾上腺素+I2

肾上腺红一定条件下N-甲基-3,5,6-三羟基吲哚(六)HPLC法

例一、重酒石酸去甲肾上腺素注射液的测定采用RPIP-HPLC-UV法；用外标一点法进行定量测定。

例二、血浆中儿茶酚胺类（肾上腺素类）药物的测定采用RPIP-HPLC-ECD法；用标准曲线法进行定量测定。

(七)衍生化GC法（GC-FID以盐酸美西律作内标物)

应用示例：盐酸芬氟拉明片的含量测定盐酸芬氟拉明＋三氟乙酰肝衍生物返回其它分析技术与方法高效毛细管电泳法用于饲料中盐酸克伦特罗与沙丁胺醇含量的测定第三节：苯丙胺类药物的分析基本结构与主要性质ACE抑制剂马来酸依那普利盐酸贝那普利2005版中国药典收载的代表药物西那普利赖诺普利主要性质1、酸碱性：分子中含有-COOH，显酸性；含有烃氨链，显弱碱性2、氨基酸特性：结构是脯氨酸的衍生物3、光学活性：分子中含有不对称中心，具有旋光性4、水解特性：本类药物大多是Pre-drug，在体内转化为活性代谢物二、鉴别试验一、物理与化学鉴别法1、熔点测定法－BP(马来酸依那普利）2、高锰酸钾反应－红色消失（氧化还原反应）3、溴－间苯二酚反应：先进行溴代反应，使溴颜色消失，再与间苯二酚反应，显棕红色4、羟胺－三氯化铁反应：先进行羟胺的生成（羟胺甲醇液＋KOH乙醇液）→FeCl3→显棕红色二、旋光法三、光谱与色谱法鉴别三、特殊杂质的检查1、马赖酸依那普利有关物质的检查：依那普利那＋依那普利双酮－采用HPLC法检查2、西那普利中有关物质的检查：A、B、C、D四个主要杂质杂质A-TLC法检查（硅胶G板，目视比较），不得超过0.1％－BP杂质B、C、D及其它杂质－HPLC法，分别不得超过0.5％、0.1％、0.2％和0.1％－BPTLC法检查A杂质制备样品液：供试品溶液（40mg/ml）、对照品溶液a（40μg/ml)、对照溶液b（0.5mg/ml）点样与展开：硅胶G板，HAc-H2O-n-Hex-MeOH-EtOAc(1:1:3:3:12)显色：KBiI4-HAc(1:10)比较：供试品如显杂质A斑点，颜色≤对照液a的主斑点。要求对照液b显示两个清晰分开的斑点时，结果有效。HPLC法检查B、C、D和其它杂质样品测定液配制：供试品溶液（0.5mg/ml)、对照溶液a(2.5μg/ml）、对照溶液b（杂质D对照品0.5mg/ml）色谱条件：ODS色谱柱，四氢呋喃－三乙胺为流动相，流速1.0ml/min，检测波长：214nm色谱系统适用性：分别进样对照溶液a和b，使对照溶液a的主成分峰为满量程的50％，在对照溶液b中西那普利与杂质D的分离度不得低于2.5。测定与评判：1、色普图记录至峰A被洗脱为止2、杂质B、C、D与西那普利的相对保留时间分别为0.6、1.6、0.93、峰面积杂质B≤0.5％（对照液a的主峰面积）峰面积杂质C≤0.1％（对照液a的主峰面积）峰面积杂质D≤0.2％（对照液a的主峰面积）峰面积其它≤0.1％（对照液a的主峰面积）（三）残留溶剂的测定1、马赖酸乙那普利中残留溶剂乙腈的检查－capillaryGC法≤0.041％样品溶液的制备：本品加二甲基甲酰胺溶解100mg/ml对照溶液的制备：取乙腈加二甲基甲酰胺溶解40μg/ml分析方法：PEG-20M为固定液的毛细管柱，FID检测器，程序升温洗脱：Injectiontem.:200℃,detectortem.:250℃,injectionvolume:1μl2、盐酸喹那普利中丙酮、乙腈、二氯甲烷、甲苯的检-GC法色谱系统适用性试验测定结果计算：乙腈和丙酮≤0.25％二氯甲烷≤0.1％制备标准溶液所取某溶剂的重量供试品量供试品溶液的色谱峰面积标准溶液色谱峰面积四、含量测定一、酸碱滴定法：利用本类药物结构中的-COOH和氮原子氨基，可进行酸碱滴定法进行含量分析1、非水滴定法马赖酸依那普利－非水碱量法滴定，以冰醋酸和无水二氧六环为溶剂，结晶紫为指示剂，高氯酸为滴定液2、水溶液中的滴定马赖酸依那普利：供试品→新沸过的冷水溶解→NaOH滴定→电位法指示终点3、