细胞分离课件

细胞与亚细胞结构的分离

SeparationofCell&Organelles北京大学医学部细胞生物学系李莉

生物学及医学研究一般涉及：

整体、器官、组织、细胞、细胞器及分子水平。 其中，细胞、细胞器及分子水平的研究，均需分离细胞或细胞器。

一、从动物组织游离细胞一)步骤二)方法1、非酶法2、酶法二、细胞器的游离内 容一、从动物组织游离细胞

细胞的微环境:细胞细胞细胞外基质Nocellslivesinisolation.Celljunction,celladhension.

细胞连接的功能分类封闭连接(occludingjunctions) 紧密连接(tightjunction)

锚定连接(anchoringjunctions)

通讯连接(communicatingjunctions) 间隙连接(gapjunction)； 神经细胞间的化学突触(chemicalsynapse)；

细胞粘附与细胞粘附分子细胞粘附（或细胞粘合，Celladhesion)：细胞通过其表面的粘附分子与其它细胞或细胞外基质成分发生的特异相互作用（细胞连接的概念着重有稳定的形态特征）。细胞粘附分子(Celladhesionmolecules,CAM):

介导细胞粘附的细胞表面分子。为跨膜糖蛋白，由较大的胞外域、疏水的跨膜区及短小的胞内域构成。细胞粘附分子介导细胞的识别与粘附，维系粘合连接，并通过参与细胞的信号转导对细胞的形态结构、行为和功能进行调节。机体的各种组织和器官都是由细胞与ECM共同组成的；ECM是机体发育过程中由细胞分泌到细胞外的各种大分子，常在细胞的周围构成高度水合的凝胶或纤维性网络；ECM对细胞不仅起着支持、保护和营养作用，而且对细胞的分裂、分化、识别、黏着、运动迁移、细胞通讯以及基因的表达等都有重要作用；ECM还与许多病理过程有关，例如创伤的修复、肿瘤转移、老年病、胶原病、心血管病、骨关节病及糖尿病等。ECMECM结构示意图

一、从动物组织游离细胞媒介：二价阳离子(尤其是Ca2+，如桥粒的中央层)；大分子(如糖蛋白和蛋白聚糖)不同组织具有不同的细胞间质成分，不同组织中，参与细胞粘合与细胞连接的大分子成分也各不相同，所以，在游离细胞时，不同组织的细胞对不同试剂和不同方法具有不同的敏感性。------游离技术复杂，游离方法多样。

有时，同一种组织可用不同的方法游离出单个细胞，但所获得的细胞在表明性质、激素反应状态及物质和能量代谢上可能各有不同。------应根据实验目的选择游离方法。游离方法成功-----细胞活率与产量均高，并尽可能地保留细胞结构与功能的完整性。

注意游离条件：1、游离剂的种类2、游离剂的浓度与作用时间3、缓冲液的成分4、pH5、溶液的渗透压与盐成分6、酶终止剂对不同动物、不同组织或不同年龄的组织，有时游离方法不能通用。

一)步骤1、用利剪剪碎组织或切成0.3~0.4mm的薄片，必要时匀浆。------组织块应尽量细小，保证细胞的供氧。2、用游离剂处理，破坏细胞之间及细胞与ECM之间的联系------在组织与游离剂保温前，保持低温以降低氧的消耗；选用适当直径的容器，以便液面的高度适宜，利于组织块的氧供给。

二)游离细胞的方法1、非酶法------较温和1)螯合剂(chelatingagent)----常用于游离 上皮组织细胞常用：EDTA(依地酸)---结合Ca2+，Mg2+ EGTA（依他酸）---结合Ca2+的能力与EDTA 相似，但在中性或碱性条件下结合Mg2+的能力大大小于EDTA。

去除Ca2+，Mg2+-----EDTA

去Ca2+留Mg2+-----EGTA

2)甘氨酸(glycine)-----可与EDTA联合应用。3)糖类(saccharide)----细胞表面的凝集素可识别并结合细胞粘合分子和细胞连接分子的糖链结构，这种作用能被相应的单糖、双糖或寡糖所抑制。4)升高pH----改变细胞表面电荷如，胚胎组织，0.5%KOH溶液调至pH9.8，3~5分钟5)机械力游离-----玻璃匀浆器，注射器(6#针头)。注意轻缓，减少膜撕裂。

2、酶法----蛋白水解酶，辅助酶 几种酶或酶与非酶试剂联合使用，效果较好。1)蛋白水解酶(proteolyticenzyme)粗胰酶(pancreatin)----混合酶，含胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、RNA酶、脂酶、淀粉酶及磷酸酶。不同批号和来源的产品，其组成成分及各成分的活性变化很大----应根据需要选择不同来源的产品。

#37℃/R.T.，Trypsin长时间(>1hr)消化纤维性组织时，组织块表层细胞可随时从纤维网架中脱落下来，每隔20~30分钟需用不锈钢网/铜网(20~50μm)滤过一次，离心收集这些细胞，以免细胞受过度消化而被破坏。

胶原酶(collagenase)-----20多种，常与胰蛋白酶联合使用，适于消化坚硬癌组织中结缔组织的纤维成分。最适pH中性属于金属酶(可能含Zn2+)，被Ca2+活化，被Mg2+抑制。牛血清不能使其灭活，其作用缓和，可用离心淘洗去除酶。商业上提供的胶原酶批号之间常有很大差异，购买时，先试几种不同来源的制品，选择效率高的，再按其批号一次足量购买。

溶菌酶(lysozyme)------作用于细胞表面糖蛋白的某些糖苷键。弹性蛋白酶(elastase)----最适pH10，pH8~9活性也较高，pH6失活。木瓜蛋白酶(papain)---是-SH酶，使用时应加入螯合剂，以防重金属与酶的-SH结合。链霉蛋白酶(pronase)---广谱，Ca2+对其有保护作用，血清无终止作用。

2)辅助酶(subsidiaryenzyme)DNA酶----部分细胞受损，DNA-蛋白质释放出来形成凝胶，凝集细胞。

透明质酸酶(hyaluronidase)-----对热稳 定，并具广泛的最适pH。配制酶溶液----用BSS（平衡盐溶液） 或培养液。

终止蛋白酶作用的方法：(a)洗涤细胞，清除蛋白酶；(b)加入蛋白质竞争性地与酶结合，常用BSA等；(c)加入蛋白酶抑制剂----广泛存在于动、植物组织及血清中。

稳定剂(protectiveagent)----隔离剂:防止从组织游离下来的单个细胞发生聚合或粘附于瓶壁上，常用Methocel(一种甲基纤维素)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、明胶(gelatin)及BSA等。成功地游离细胞-----精心选择游离试剂，注意pH、温度、离子种类和强度、作用时间及辅助试剂。方法的建立必须通过实验来摸索。不同来源、不同批号的酶制剂可能有差异二、细胞器的游离 通过机械或化学的方法破坏细胞界膜和细胞内膜的连续性----制备组织或细胞匀浆。常用方法： 1、Dounce玻璃匀浆器---手动，适于培养细胞和软组织细胞制备匀浆。 2、Potter-Elvehjem匀浆器----电动或手动，适于软组织(如肝)的匀浆。 3、叶片刀匀浆器(blader)---电动，适于较坚硬组织(如肌肉、心脏等)的匀浆。 4、超声波匀浆器 5、用爆发的负压破碎细胞界膜---适于细菌匀浆。

三、细胞与细胞器的分离细胞的分离：

大小、密度---密度梯度沉降 表面电荷---电泳 表面特殊成分---亲和吸附细胞器的分离： 差速离心 密度梯度沉降

一)沉降法纯化细胞或细胞器1、差速离心(differentialcentrifugation)离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。1、差速离心(differentialcentrifugation)在密度均一的介质中，分别在不同大小离心力场(从小到大)的作用下沉降而分离。由于各种颗粒于离心沉降前在介质中均均匀分布，所以，某些慢沉降颗粒被快沉降颗粒裹到后者的沉淀块中，而使分离不够完全-----可重复2~3次，进一步纯化。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀由于连续离心会损伤细胞，只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。细胞器在差速离心中的沉降顺序：核----线粒体----溶酶体与过氧化物酶体----内质网与高尔基体----核蛋白体1、差速离心(differentialcentrifugation)由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，所以，差速离心分离得到的组分常不只一种，尤其是质膜常与各种细胞器混杂沉降。差速离心可将细胞器初步分离，再进一步通过密度梯度沉降进行分离纯化。分离的细胞器还需经过鉴定。各种细胞器都有其标志物，如溶酶体的标志物为酸性磷酸酶。1、差速离心(differentialcentrifugation)

2、密度梯度沉降(densitysedimentation) 用一定的介质在试管中形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部或底部，通过重力或离心力场的作用，使细胞分层分离。 分为速度沉降和等密度沉降平衡。（1）速度沉降(velocitysedimentation)

细胞或细胞器在十分平缓的密度梯度介质中，按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。介质密度较低，最大密度小于被分离生物颗粒的最小密度。分离亚细胞结构，需加离心力场。在沉降最快的生物颗粒达到管底前停止沉降，并将各部分别收集。低温下进行，保护细胞及亚细胞结构的功能。（1）速度沉降(velocitysedimentation)

分离纯化细胞的优点：(a)大多数细胞密度相差不多，而大小差别明显----分离效果较好；(b)介质密度低-----不需高速；(c)时间短，外力轻-----保持生物材料在结构与功能上的完整性；(d)可在无菌条件下进行全部操作----分离的细胞可进行培养（1）速度沉降(velocitysedimentation)

（2）等密度沉降平衡

(isopycnicsedimentation)细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力、足够长时间，或沉降或飘浮到与自身密度相等的介质处。适于分离密度不等的颗粒。介质密度较高，其最大密度应大于被分离组分的最大密度。介质梯度要求有较高的陡度，不能太平缓。高速或超速离心，时间也较长-----对细胞不利。（2）等密度沉降平衡

(isopycnicsedimentation)A等速度沉降，B等密度沉降密度梯度沉降法分离细胞常用的介质必须符合的条件：(a)能产生一定陡度的密度梯度，且密度高时粘度不高；(b)pH中性或易调为中性；(c)浓度不同时渗透压的变化不大（sucrose只能用于分离细胞器）；(d)对细胞无毒。常用的介质：清蛋白、Ficoll（polysucrose，速度沉降或重力沉降）、Percoll等。Percoll为PVP硅胶，广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒；既适于少量细胞的分离，又适于区带大批量分离细胞；可分离死、活细胞，30%Percoll一般可截住死细胞。UV有吸收。为防止细胞粘附于管壁，可使用聚碳酸酯试管。

二)电泳法分离细胞 细胞表面带正负电荷，在一定pH环境下，细胞表面带净电荷，在外加电场中向一定方向泳动。 具有不同表面电荷的细胞器也可通过电泳达到分离。

三)亲和吸附法分离细胞 亲和吸附是一种特异性吸附反应。吸附剂被共价交联到直径较大、珠粒范围较窄的琼脂糖凝胶上，当细胞混悬液通过柱内珠粒时，与吸附剂结合的细胞被留在凝胶床上，而不与吸附剂作用的细胞则穿过凝胶柱流出，然后，用适当的去吸附剂将被吸附的细胞洗脱下来。1、抗原---抗体(吸附剂)前提：细胞表面存在特异性抗原。 无相应抗原的细胞----很快流过吸附柱(高活率，高回收率) 有相应抗原的细胞----抗原与抗体结合力强，且难以得到足量的抗原用于洗脱(回收率不高)适合从细胞悬液中去除某种细胞。如，从骨髓细胞中去除白血病细胞，使用白血病细胞特有的抗原的抗体作为吸附剂1、抗原---抗体(吸附剂)2、糖蛋白---凝集素(吸附剂)细胞表面存在着多种糖蛋白，其糖链结构因细胞种类、分化阶段及功能状态而异，因此，可用此法分离不同种类、不同分化阶段或不同功能状态的细胞。糖基与凝集素的结合可逆性大，此法可得到高活率、高产量的特定细胞，方便、重复性好。常用单糖、双糖或寡糖作为去吸附剂，经济易得，对细胞无损伤。避免凝集素与细胞接触时间超过30分钟，否则用相关的糖不能使细胞与凝集素脱离，此外，也易发生非特异性结合或内吞，刺激有丝分裂或引起编程性死亡。2、糖蛋白---凝集素(吸附剂)

特异识别 去吸附剂

花生凝集素(PNA) D-Gal D-Gal 大豆凝集素(SBA) GalNAc GalNAc 蜗牛凝集素(HPA) GalNAc GalNAc 麦胚凝集素(WGA) GlcNAc GlcNAc 生物化学与分子生物学实验常用数据手册

吴冠芸、潘华珍主编，科学出版社，1999年第一版

P220，“常用外源凝聚素的糖特异性”

3、受体---配体(吸附剂) 常用过量的配体或竞争性抑制剂作为洗脱剂。（四）根据细胞的生物学特性分离细胞如巨噬细胞可粘着于铺有LN的、甚至裸露的玻璃或塑料表面，而其它血细胞则不能。腹水液→铺有LN的培养瓶，保温一定时间→巨噬细胞粘着

五)流式细胞术分离细胞

流式细胞术（flowcytometer）是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。用流式细胞计分选细胞

免疫磁性分离法(ImmunomagncticSeparation)免疫磁性微球(Immunomagncticbeads,IMB)是免疫学和磁载体技术结合而发展起来的一类新型材料。IMB是包被有单克隆抗体的磁性微球，可与含有相应抗原的靶物质特异性地结合形成新的复合物。通过磁场时，这种复合物可被滞留，与其它组分相分离,该过程称为免疫磁性分离法。免疫磁性分离简便易行，分离纯度高，保留靶物质活性，且高效、快速、低毒，可广泛应用于细胞分离和提纯、免疫检测、核酸分析和基因工程、作靶向释药的载体等领域。免疫磁性分离法(ImmunomagncticSeparation)磁性微球结构

磁性物质高分子层功能配基

磁性微球由载体微球和配基结合而成。理想的磁性微球为均匀的球形、具有超顺磁性及保护性壳的粒子。磁性材料：γ-Fe2O4、Me-Fe2O4（Me=Co，Mn，Ni）、Fe3O4、Ni、Co、Fe、Fe-Co和Ni-Fe合金等，目前被研究最多且应用最广泛的是铁及其氧化物（Fe、Fe2O4和Fe3O4等）。高分子材料：聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、多糖(纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖等)和牛血清白蛋白等。表面常带有化学功能的基团,如-OH、-NH2、-COOH和-CONO2等，使得磁性微载体就几乎可以偶联任何具有生物活性的蛋白。功能配基：配基必须具有生物专一性的特点,而且载体和微球与配基结合后不影响或改变配基原有的生物学特性，保证微球的特殊识别功能。免疫磁性微球的分离原理

直接法对细胞进行分类抗CD3磁球磁球结合T细胞加入B和T细胞中负向选择正向选择磁架进行分离间接法对T细胞进行分离单克隆抗体CD3羊抗鼠修饰磁球BiomagT细胞T细胞免疫磁性微球的应用

1、用于细胞分离和提纯使用IMB进行分离细胞有两种方式；直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法，称为阳性分离；用免疫磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离。免疫磁珠技术可用来分离人类各种细胞如红细胞、外周血嗜酸/碱性粒细胞，神经干细胞、造血细胞、T淋巴细胞、γδT淋巴细胞，人类关节滑膜细胞，树突状细胞，内皮细胞、及多种肿瘤细胞等。2、体外细胞扩增树突状细胞(Dendriticcells，DC)、造血干、祖细胞等细胞在科研及临床上都具有巨大的应用价值，但是在体内含量较少而且分布广泛，难以获得大量高纯度的细胞，限制了该领域的发展。体外扩增辅以免疫磁珠技术有望解决这一难题。在这一过程中，用免疫磁性微球分离纯化出待扩增的细胞，用特定的因子组合培养，许多研究者用这样的方法寻找扩增的最佳细胞因子组合和移植的最佳时机。免疫磁性微球的应用（续）1

3、免疫检测免疫磁性微球可以简单快速地从血液或者骨髓中富集、清除癌细胞，广泛地应用于疾病检测、癌症治疗和自身骨髓移植中，还被用于从母体外周血中分离胎儿细胞进行无创性产前诊断。免疫磁珠分离技术用在微生物检测方面能准确快速地检测出样品中的ColiO157，这对于食品卫生和预防疾病的传播具有重要的意义。PCR技术与免疫磁珠技术结合在分子生物学、医学诊断学等方面有非常重要的作用，这方面的研究在医学检测方面的应用，可以简便快速地诊断膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、腹膜胃癌、上皮肿瘤细胞等，使免疫磁性分离技术的应用更加广泛。4、在核酸与基因工程上的应用免疫磁球可以看作是亲合层析技术中的微型配基裁体，借助亲合素-生物素（Biotin-Avidin）系统免疫磁球可与非蛋白质结合，生物素和亲合素间有着高度的亲和力，两者的结合迅速、专一、稳定，在分子生物学、医学、免疫组织化学等领域中的应用也越来越广泛，与生物磁珠技术结合后，更是产生了诱人的发展前景，并广泛地应用于分离纯化RNA、mRNA、核酸片段等及相关研究。免疫磁性微球的应用（续）2

5、用于分型免疫磁珠法可被应用于临床器官移植供受者的快速选配。在高梯度磁场下,用免疫磁珠法分离静脉或腹腔血中T、B淋巴细胞，并利用分离的淋巴细胞进行HLA-ⅠⅡ类抗原分型。如采用磁珠技术和单抗试剂建立起可在1.5h完成HLA-ⅠⅡ类抗原一类分型的新方法，还可应用免疫磁珠分离技术进行肾移植供受体的HLA分型、探讨血液病患者反复血小板输注的治疗效果与HLA之间的相关性。6、

用作靶向释药系统的载体免疫磁性微球作为靶向释药系统的载体可使免疫磁性微球上的抗癌药物更易与癌细胞接触，服用这种制剂后，在体外适当部位用一适宜强度的磁铁，将磁性微球引导到体内特定靶区，提高了杀伤癌细胞的效果。很多研究者使用不同的方法制成了针对不同癌细胞的免疫磁性微球，作为靶向释药系统的载体并在实验中证实这种释药载体具有良好的功效。Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；(4)使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。

(一)原理:

常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是1.077±0.001的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(二)方法:

1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。

2.取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。

3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank’s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。

6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。

用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化

淋巴细胞和淋巴母细胞

(一)原理Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm／kgH２O),粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外