启动子调节缬氨酸代谢生产课件

谷氨酸棒杆菌利用启动子活性调节机制，进行L-缬氨酸生物合成代谢途径的研究关键酶和编码基因乙酰羟酸合酶(AHAS)——由ilvB和ilvN共同编码乙酰羟酸同分异构酶(AHAIR)——由ilvC编码二羟酸脱水酶(DHAD)——由ilvD编码支链氨基酸转氨酶(TA)——由ilvE编码异丙基苹果酸合酶（IPMS）——由leuA编码泛酸酮羟甲基转移酶（KPHMT）——由panB编码丙酮酸：醌氧化还原酶（PQO）——由pqo编码丙酮酸羧化酶（PC）——由Pyc编码构建谷氨酸棒状杆菌L-缬氨酸生产菌株的多种基因操作方法：1、编码苏氨酸脱氨酶的ilvA基因的缺失（TD）。2、panB基因的缺失导致泛酸营养缺陷型。3、aceE基因的缺失，这一基因是编码丙酮酸脱氢酶复合体E1p亚基的。4、Pyc和pqo基因的缺失5、Pgi基因（磷酸葡萄糖异构酶）的缺失，这一失活导致了NADPH供应的增加6、编码乙酰羟酸合酶调节亚基的基因ilvN的突变7、将ilvBNC操纵子和ilvD和（或）ilvE克隆在一个多拷贝质粒载体中策略策略一：过量合成生物合成途径中的限速酶。与生物合成途径相关的限速酶的过量合成是代谢工程中最常用的策略之一。策略二：利用启动子调节进行基因表达的调控。这种策略避免了两种极端，一种是酶基因的强烈过表达被限速，另一种是通过基因缺失导致的分支或竞争途径的消除。通过利用各种优势构建启动子，一种途径中的全部基因可以表达到确保通过该途径最佳的流量水平。通过对与缬氨酸生物合成途径及竞争途经相关的染色体基因的启动子进行修饰，构建缬氨酸生产菌株。实验方法1、DNA处理和转化2、质粒pKSAC45的构建及其对于谷氨酸棒杆菌染色体基因操作的应用3、启动子克隆4、氯霉素乙酰转移酶测定5、采用高效液相色谱法测定氨基酸浓度结果一、基础L-缬氨酸生产菌株的最佳培养条件L-缬氨酸生产菌C.glutamicumATCC13032ilvNM13∆panB∆ilvA是L-异亮氨酸、泛酸的营养缺陷型、乳酸合成酶抗反馈抑制突变基因的携带者在提供各种浓度的异亮氨酸的CGXⅡ培养48h后缬氨酸的量（加有0.5μM的泛酸）使用0.4mM的L-异亮氨酸产出最高浓度的L-缬氨酸（95mM)0.6mML-isoleucine产出72mML-valine2mML-isoleucine产出27mML-valine二、ilvN,ilvD和

ilvE转录起始位点的确定ilvD的启动子相比较最弱（0.014±0.01U每毫克蛋白质),ilvE的启动子中等(0.18±0.02U每毫克蛋白质)，ilvN的启动子最强(0.6±0.09Umgprotein-1)。翻译起始密码子与转录起始位点的距离在ilvN，ilvD，ilvE中分别为377，120，1bp。所研究基因的转录起始位点是通过引物延伸分析确定的。结果四、

ilvD，

ilvE,ilvA

和leuA基因突变启动子的构建及鉴定为了加强表达缬氨酸生物合成中的基因，我们诱变了ilvD和ilvE启动子的-10区域以增加启动子活性（启动子上调突变）。携带突变启动子的片段P-ilvD(1184bp）、P-ilvE（1108bp）与载体pKSAC45连接后分别导入到敲除了∆P-ilvD或∆P-ilvE基因的谷氨酸棒杆菌染色体上，此过程应用的是基因置换技术。筛选出缬氨酸及异亮氨酸营养缺陷型回复突变为原养型的克隆体。将已验证的突变启动子片段亚克隆在pET2上，然后通过测定在完全培养基上培养后得到的细胞提取物中CAT报告基因的活性以测定启动子活性。（表5）筛选出突变启动子P-ilvDM14和P-ilvDM7（比野生型P-ilvD高18和100倍）以及P-ilvEM6（比野生型P-ilvE高22倍）进行进一步实验。结果四、

ilvD，

ilvE,ilvA

和leuA基因突变启动子的构建及鉴定在谷氨酸棒杆菌ilvNM13△panB△ilvA中敲除的等位基因ilvA被含P-ilvAM1CG的完整ilvA基因所取代。正如预期的那样，由此产生的营养作用缓慢的谷氨酸棒杆菌ilvNM13∆panBP-ilvAM1CG生长更加缓慢（与野生型菌株相比）。但是，不同于亲本ilvA菌株，在添加或者不添加L-异亮氨酸的基本培养基中得出了相同的生物量（OD600=35）。异亮氨酸渗漏突变型和营养缺陷型菌株指数时期的增长率和在培养基中含有2mM异亮氨酸（分别μ=0.116±0.025和0.118±0.020h−1,）时是相似的，但渗漏缺陷型菌株在限制条件下（没有异亮氨酸）比营养缺陷型在含0.4mM异亮氨酸（分别μ=0.063±0.018和0.087±0.022h−1）条件下生长缓慢。结果谷氨酸棒杆菌ilvNM13∆panBP-ilvAM1CG比亲本的营养缺陷型菌株产生L-缬氨酸多10%将启动子P-ilvDM14、P-ilvDM7和P-ilvEM6分别引入并组合到谷氨酸棒杆菌ilvNM13菌株中。在所有情况下，甚至在培养基上没有生产抑制时缬氨酸的产量都有所提高。启动子P-ilvDM14和P-ilvEM6的结合或P-ilvDM7和P-ilvEM6的结合被引入谷氨酸棒杆菌ilvNM13∆panBP-ilvAM1CG的染色体中。目的菌表现出20-30%产量的提高高效无质粒的缬氨酸生产菌株C.glutamicumilvNM13ΔpanBP-ilvAM1CGP-ilvD