动物组织基因组的提取课件

实验一、动物组织基因组DNA提取实验一动物基因组DNA的提取一、实验目的学习和掌握从动物组织或细胞中提取核酸的原理和操作技术了解提取DNA的几种方法，原理和优缺点学习测定DNA含量和质量的基本原理及方法二、实验原理1、核酸的分类DNA(脱氧核糖核酸)

主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA（核糖核酸）

存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。

除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。分离纯化核酸总的原则：2、核酸制备的一般原则核酸纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子(蛋白，脂类，多糖类)的污染。核酸制备时应注意的事项:

①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。②减少化学因素对核酸的降解。③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温④防止核酸的生物降解：排除核酸酶。

⑤排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。核酸酶的抑制和抑制剂DNase抑制

①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。

②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。常用的RNA酶抑制剂

焦磷酸二乙酯（DEPC）抑制强烈、不彻底

异硫氰酸胍有效抑制、分解核蛋白氧钒核糖核苷复合物有效抑制

RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）有效抑制其它：SDS、尿素、硅藻土等有效抑制作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。

如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC核酸制备中常用的蛋白质变性剂3.核酸制备的一般步骤：破碎组织细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）

微生物：溶菌酶、SDS裂解。

高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。

酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。

动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。

细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂2）破碎抽提核酸除去杂质首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离使核酸与蛋白质分离除去脂类多糖的除去3）核酸的纯化

根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。

4）核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质

温度：

4℃样品经常使用-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存,避免反复冻融

保存介质：

灭菌水

TE缓冲溶液(最常用)：

10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0三、动物基因组DNA的提取（2）阴离子去污剂法:

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。三、动物基因组DNA的提取（3）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。1）样品预处理取新鲜动物组织25-50mg（组织量不宜过多，否则容易导致裂解不完全而堵塞离心柱），组织剪碎或者切成小块，直接放入匀浆器中匀浆。2）加入600μl的LysisBuffer，颠倒充分混匀。如需消化RNA，可加入20μlRNaseA，颠倒混匀，室温放置5min。3）加入10μlProteinaseK，混匀。56℃水浴45min-1h，其间颠倒混匀数次直到看到组织完全裂解，裂解完全的标准为液体变得清亮及粘稠。（此步骤可以过夜处理）2.操作步骤4）12,000rpm离心10min，将上清转入新的离心管中，加入800μl无水乙醇，混匀。5）将液体转入离心柱（一次加不完，可分次转入），12,000rpm离心1min，弃废液。6）加入700μlWashbufferA（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30s-1min，弃废液。

7）加入700μlWashbufferB（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30s-1min，弃废液。称取肝脏0.5g冰冷的生理盐水清洗（3次）剪碎5ml生理盐水匀浆各组取1/10组织细胞液移至1.5ml离心管加600ulLysisBuffer加20ulRNaseA颠倒混匀，放置5min加10ulProteinaseK混匀56℃水浴，45min颠倒混匀数次至液体变清亮及粘稠12000rpm，10min离心取上清转入新离心管加800ul无水乙醇混匀转入离心柱可分次转入12000rpm，1min离心弃废液，加入700ulWashbufferA12000rpm，1min离心弃废液，加入700ulWashbufferB12000rpm，1min离心弃废液，加入500ulWashbufferB12000rpm，1min离心弃废液12000rpm，2min离心将离心柱置新离心管中，开离心柱盖，放置5min柱膜中央加100ul65℃预热的TEbuffer放置3min12000rpm，30sec离心取离心后所得溶液再加入离心柱中，放置2min12000rpm，2min离心收集离心后所得溶液，即为纯化后基因组DNA3.注意事项——材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集3.注意事项——细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁高温温浴时，定时轻柔振荡3.注意事项——核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解

组织匀浆液（装入10ml离心管中）10ml

100mmol／LNaCl：0.2ml（5MNaCl）25mmol／LED