肌肉组织的氨基转换作用实验报告

篇一：实验六纸层析法观察转氨基作用实验报告实验六纸层析法观察转氨基作用验名称】：纸层析法观察转氨基作用：28°实验目的：1习氨基酸纸层析的基本原理。2握氨基酸纸层析的操作原理。实验原理：转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT催化如下反应：α—酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最实验材料与仪器：1、0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液中,以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至100ml。4、0.1mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后，加磷酸盐缓冲液至100ml酸盐缓冲液中，以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至50ml。仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。（四）实验步骤2、酶促反应过程（1）取离心管两支，编号：1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆0.5ml。（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5ml,0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5ml,0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液1.5ml,（3）37℃保温，30分钟后取出，保温完毕。3径,用铅笔划一圆线作为基线,上四等份处标清四点编号作为点样原点。（2管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在12（3打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,入滤纸中心孔中，下端剪成须状。（4皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培养皿盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。当层析液前缘到离滤纸边缘（5）显色：将上述滤纸平放在培养皿上，滴％茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽实验结果记录：1实验讨论：氨酸，则未知溶质a为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，丙氨酸，所以色斑只有一个。2析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。3析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛。4、点样点不宜过大，直径小于0.5cm.篇二：浙大生化实验报告氨基转换反应报告课程名称：生化实验甲指导老师：成绩：________________实验名称：氨基移换反应及其产物的鉴定实验类型：同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得验目的和要求1习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；2习纸层析的原理和操作技术。二、实验基本原理1.氨基移换反应：在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发生的互换反应。转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT活性最强。各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（glutamicpyruvictransaminase,GPT）、谷草转氨酶（glutamicoxalacetictransaminase,GOT）活性较高。GPT催化下的转氨基反应为：L－谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化－谷氨酸氧化脱－，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物－酸。本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和α—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT)用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。2.纸层析原理：层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液）中，在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸样品的分离图谱。3.茚三酮的显色原理：+合物验材料与试剂1验材料动物肝脏肝或猪肝）2验试剂⑴0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）（转氨基反应所需缓冲溶液）；⑵0.1mol/Lα－丙氨酸（pH7.4）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）；⑶0.1mol/Lα－酮戊二酸（pH7.4）（转氨基反应的底物）；⑷0.1mol/L谷氨酸（pH7.4）（纸层析的标准样品）；⑸展层溶剂－酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（3001）（纸层析用）；⑹10％三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）；⑺0.25%碘乙酸（抑制L－谷氨酸脱氢酶活性）；⑻显色剂（0.1%茚三酮乙醇溶液）。验器材与仪器⑴⑵试管及试管架；⑶恒温水浴箱（37℃、100℃）；⑷铅笔、尺和圆规；⑸毛细管（直径0.5mm)；⑹新华定性滤纸（直径11cm）；⑻电吹风；⑼⑿烘箱（80℃）。验操作方法和步骤1酶液的制备2移换反应3⑴心处截一小孔（孔径约0.2cm)⑵点样：用毛细管依次点标准α－丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)各点2次，其余1－4号管样液各点2～3次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm⑶展层、显色将下端剪成须状,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中,平放在盛有展层溶剂的康氏皿中,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中,再在滤纸上盖上另一康氏皿（图1）。展层剂沿灯心上升到滤纸,再向四周扩散,待溶剂前沿距康氏皿外槽内缘0.5cm(约需半小时)，取出滤纸，用镊子拔出灯心，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒茚三酮－乙醇溶液，用电吹风热风吹干或放入烘箱（80℃）中显色3min。4结果分析1点样的时候用的毛细管可能受到了污染；样之前可能碰到了桌面上小液滴。论、心得1免污染滤纸，不要用手接触。2样时，毛细管与滤纸轻微接触，不要留下痕迹。3茚三酮显色时，需要戴手套，免得手部被染色。4面干净，免得污染滤纸。实验四转氨基作用（纸层析法）氨基酸分子上的氨基转移到α-酮酸分子上的反应过程称为转氨基作用（或称氨基移换作用）。转氨基作用是氨酸代谢的重要反应之一，由转氨酶催化。经转氨后，原来的α-—氨基酸变成了相应的α-—酮酸，原来的α-—酮酸则成为新的、相应的α-—氨基酸。本实验观察谷氨酸与丙酮酸在肌匀浆中的谷氨酸—丙酮酸转氨酶（简称GPT）。然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。为反应中须加一碘醋酸（或—溴醋酸），以抑制谷氨酸和丙酮酸的其它代谢过程。1．0.9%NaCl溶液。替）。1匀浆的制备（由实验室准备室制备）却后，离心（200r/min原指有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离用于无色物质的分离。层析法除了吸附层析以外，还子交换层析、分配层析和亲和层析等。纸层析是分配层析中种。层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分溶质在固定相中的浓度（a=溶质在流动相中的浓度（物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。持物的分配层析，纸纤维上的羟基具有亲水性，因此相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂沿着滤下而上流动的，称为“上行法”；自上而下流动的，称为“下行法”。称为原点），进行展开，样品中的种种溶质（如各种不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同的溶等，于是就将这些溶质分离出来，形成距原点不等的点。层析点中心的距离Rf=————————溶剂前沿的距离只要条件（如温度、展开溶剂的组成、滤纸的质量等）不变，值是常数。故层析后，各种溶质在滤纸上的位置可用适当的化学或物理方法处理而使其显。对于氨基酸常用茚三酮使之显色。1．饱和水的酚：取50g重蒸馏酚（隔水加热溶化，量取50ml。）与25ml水，在分液漏斗中充分混匀，于暗处放置过夜（7—10小时），分成两层，收集下液放入棕色瓶中保存。注意：在重蒸馏和移取酚时，务必防止溅在皮肤上，若溅在皮肤上，立即用酒精擦洗，以免腐蚀皮肤。2．0.1—0.25%茚三酮丙酮（或乙醇）溶液。1．向层析缸中装入饱和水的酚（其深度约1.5cm2．取宽4.5cm，长18cm滤纸一条，（手指不可接触纸面）在滤纸条一端2cm处划一水平线（原线），在此线上以间隔相等的距离用铅笔画四个直径约2—4mm的小圆圈，标明号码。3毛细管向各小圈中央点上各种不同的氨基酸溶液，并记录之。例如：第一4、二次，再干燥。然后将此纸条插入上述准备好的层中。先横玻棒上（或用棉线代替），调节其高度，使纸条的下端浸入酚内约1cm(勿使氨基酸小点与溶剂直接接触)，然后把盖盖紧。吹风吹干，使酚蒸发。6．将已烘干的滤纸浸入茚三酮酒精溶液，