抗生素基因克隆课件

抗生素基因克隆进展

抗生素的基因克隆大致可分为四种类型，即：（一）抗生素抗性基因的克隆；（二）抗生素生物合成调节基因的克隆；（三）抗生素结构基因的克隆；（四）通过基因重组产生杂合抗生素。

第一部分抗生素抗性基因的克隆一、抗生素的抗性基因抗生素产生菌为了克服抗生素的自身毒性或提高对自身抗生素的耐受性，通常具备某些特异的基因，其产物包括某些修饰酶或细胞因子，从而使抗生素失活、改变抗生素作用部位（靶点）的结构或减少抗生素在细胞中的积累，而编码这些酶及因子的基因就被称为抗生素的抗性基因。二、抗生素的抗性机制对抗生素进行修饰的酶包括核糖体RNA-甲基化酶、乙酰转移酶、磷酸转移酶等之外，还包括一种细胞因子的作用在内。这种因子可以使细胞加快抗生素的分泌以减少细胞内的抗生素含量。一般来说，抗生素产生菌所具有的自身抗药性是由一种以上的机制综合作用的结果，这是科学家们进行了一系列遗传分析及基因克隆总结出来的。已被克隆的抗性基因见59页表4-1

三、扩增抗性基因抗性基因的表达是微生物进行抗生素生物合成的前提条件，且其表达程度对于抗生素的生物合成起调节作用。瑞士Davies发现，当用高拷贝的载体PIJ702将6′-N-乙酰转移酶基因克隆到卡那链霉菌(S.kanamyceticus)及新霉素产生菌——弗氏链霉菌(S.fradise)中后，可使卡那及新霉素的产量提高p60（图4-1）。运用了高拷贝的质粒载体进行克隆，因此使细胞中AAC6′-N-乙酰转移酶的浓度大大提高。它与产生菌中原有的抗性基因共同作用，使产生菌对自身抗生素的耐受性大大提高，从而提高了抗生素的产量。这也是基因剂量对抗生素生物合成进行调节的一个实例。

表达正调控部分(p74)1、提高生物合成中关键产物的表达波赛链霉菌dnrR1和dnrR2基因与菌对柔红霉素的耐受性有关，可显著提高其中的关键产物ε-紫红霉酮产量。三、克隆部分生物合成基因

方法：A、测定酶表达状况B、用阻断突变株来筛选C、插入失活法D、抗性基因为探针E、PCR法F、同源性探针四、克隆全部结构基因（4）以抗生素的抗性基因作为探针去克隆结构基因；（5）根据酶的部分氨基酸序列合成小片段探针DNA，并以此去克隆结构基因；（6）直接克隆完整的抗生素结构基因簇，并将有其送入适当的受体中进行表达；（7）在已知两种不同的抗生素结构基因的同源性之后，用已克隆的某一抗生素的基因作为探针去克隆另一种具有同源序列的抗生素结构基因。

诸多的基因克隆的方法中，我们认为突变克隆及用人工合成的寡聚核苷酸片段作为探针来克隆抗生素基因是最巧妙的方法。

Hopwood曾经预言了方法（5）的可行性，即根据酶的部分氨基酸序列人工合成相应的寡聚核苷酸片段，并以此作为探针，克隆并组建生物合成酶的基因库。Seno

等在1986年填补了这一空白。1、克隆核糖体生产型全部结构基因，提高产量Nagano等报道了用大肠埃希氏菌(E.coli)基因工程菌株提高酚霉素(phenomycin，PHM)的产量。PHM是一种抗癌抗生素，其原始产生菌单位很低。用核糖体合成方法，如酚霉素（PHM）提高了产量(p75)。2、结构基因克隆第二部分蛋白质工程例如：中科院上海生命科学院植物生理生态研究所姜卫红等人，改造青霉素G酰化酶，使酶的稳定性提高8倍，且水解转化率提高。蛋白质改造可用：一、定点突变技术重组PCR突变技术

限制性内切酶切片段取代法化学全合成三、体外定向进化技术酶的体外定向进化技术，又称分子进化，就是在实验室模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），通过容错PCR等方法，对编码酶的基因进行随机诱变，再通过高通量筛选或选择方法定向选择出性能更加优良的酶或者创造出自然界没有的而且具有优良性质的新酶。第三部分途径工程（代谢工程）

途径工程（PathwayEngineering）是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。红霉素的生物合成途径红霉素的分子结构由14碳的红霉内酯、脱氧二甲胺基己糖以及红霉糖三部分组成，主要由红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)产生。其生物合成途径极其复杂，需要30步酶促反应，与其他聚酮化合物(如羟四环素、莫能菌素、制霉菌素等)的生物合成途径具有明显的相似性。

另一种产生大环内酯新母核的战略是半合成法，即将二酮中间体的类似物交由聚酮合酶进行处理。例如，将外源二酮化合物装载到KS2(模件2的KS)的活性巯基上，进一步转化为含有新结构的最终产物。应当说明的是，缺失