分子病理学技术进展及临床应用课件

分子病理学技术进展及临床应用

(第一部分)来自临床的问题ContemporaryUnderstandingofCarcinogenesisbymolecularbiologyasourintroductionMorethan100yearsago(1830),BritishphysicianThomasHodgkindiscoveredatypeofLymphomawithhisnakedeyes.Inthetime,obviouslyThomasHodgkindidneverknowR-Scellsinhiscasesbeforethemicroscopeavailableinclinic.Whileatpresenttime,forus,whatcanbedownwithournakedeyesratherthenwithmicroscopeormodernmoleculartechniques?Thecellularelementsin

lymphoid&hematopoietictumorsarethekeytounderstandanddiagnosetheirdiseases.Evenmore,themoleculesintherelatedcellsarethekey,especiallyinvolvedinthedevelopmentanddifferentiationoflymphoid&hematopoieticcellsThatisthebeginningofourstorytoday.UnderstandingofLymphocyteDevelopment

1950s-2010structureandfunctionoflymphoidtissueGermenalCenter(GC)：structure，function，transformationCapsularandafferentlymphaticsCortexCortexMedullaHilusEfferentlymphaticvesselsTrabeculaeMedullarysinusesMedullarycordsGCFollicleThymus-dependingzone

Subcapsularsinus

ReticulumsupportinglymphatictissueCouldyourecognizethefollowingcellularelementsinlymphnode?GerminalcenterMantlezoneMarginalzone

T-zone

Understandingbasedon70’soflastCenturyInterfolliclezoneTlymphocyteTlmmunocyteBlmmunocyteLymphocytetransformincenterofFollicleMemorycellPlasmacellParadigmofLymphocytetransformBlymphocyteFDCBnon-cleavedcellBcleavedcellOnlybymorphologyCentroblastBlastImmuoblastMacrophageFDCCentrocyteTcellMacrophageFDCLennert’sPresumptionbasedon80’soflastCenturyGerminalcenterDarkzoneLightzoneMantlezone

Mantlezone

Marginalzone

ProliferationzoneSelectedforapoptosisOn-goingmutationbymorphologyandimmunotypingconsideringmoleculareventsUpdatetoB-lymphocytedevelopmentmodelin2000’sBcelldifferentiationbyimmuno-markers

Bcelldifferentiationwithanatomicalsitesofvariousstages

Couldyourecognizecellularelementsasfollows

inlymphnode?GerminalcenterMantlezoneMarginalzone

T-zone

UnderstandingofBcelldifferentiationuntil2005byHSteinNaiveBcellDCSomaticHypermutation/AffinityMaturationClassSwitchingIGM→IgG,IgAMemoryBcellPlasmacellApoptosisGerminalCenterV(D)JrecombinationApoptosisAntigenDCCentroblastsCentrocytesBoneMarrowPost-GerminalCenterBBBBBBBBBBTTPrecursorBLymphoblastBCL2↑IRF4↑BCL2↓BCL6↑DecreasedAffinityIncreasedAffinityBCL6↓NoBCRTcell-richzoneIntactBCR?IgHV clonalrearrangement somatichypermutation!WhathappentoTcellsinceithasbeenlessmentioned

ThecontemporaryunderstandingofBandTcelldifferentiation2009-2010Understandingofthelymphocytedifferentiationandtransformationbymultipleapproachesinl.morphology,immunotypingandmolecularmeans.一、临床分子病理学常用方法免疫组织化学基因克隆性重排的检测FISH及CGH等位基因不平衡分析杂合性缺失（LOH）的检测微卫星DNA不稳定性（MSI）的检测Forpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-201509（一）免疫组织化学及其应用1．免疫组织化学的相关理论和技术1．1．免疫组织化学的工作原理

已知的特异性抗体或抗原能特异性结合通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶，金属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色）借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构Forpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-2．2．免疫组织化学的应用范围及优点：2．2．1．应用范围：(1)提高病理诊断准确性(2)对疾病的预后和治疗的意义激素(3)癌基因蛋白的应用(4)对肿瘤增生程度的评价ki-67,PCNA(5)微小病灶的发现微小癌，微小病灶（如羊水栓塞）(6)在肿瘤分期上的意义(7)指导肿瘤的治疗(8)免疫性疾病的辅助诊断(9)病原微生物的检测Forpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-20142．常用免疫组织化学方法：A、一步法B、二步法C、三步法D、多步法间接法金银法PAP和BigBeeAPAAPABC法

EnVision法BT法（CSA：Catalyzedsignalamplification）1:50、1:200、1:500、1:500、1:1000、1:5000、1:5000,1:106

E.ABC法

F.EnVision近年来的新方法:G.CSA法（Catalyzedsignalamplification）

BT法Forpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-20120910CSA原理图CSA法H.免疫组化-原位杂交的联合应用I.TUNEL-免疫组化在细胞凋亡检测中的应用

凋亡是一个基因调控、耗能的主动过程，也称之为程序性细胞死亡(programmedcelldeath，PCD)。

凋亡是单个细胞或数个细胞的死亡，死亡细胞的质膜(细胞膜和细胞器膜)不破裂，不引发死亡细胞的自溶，也不引起急性炎症反应。形态学特点：

电镜下，凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集、不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一、大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解、胞浆多发性芽突；胞浆芽突迅速脱落，形成许多凋亡小体（apoptoticbodies）。凋亡小体外被以胞膜，其胞浆中含有细胞器，核碎片可有可无。凋亡小体迅即在局部被巨噬细胞和相邻的其他细胞(例如上皮细胞)吞噬、降解。细胞凋亡和细胞坏死的超微形态比较。

光镜下，凋亡细胞胞浆浓缩，强嗜酸性，可有可无固缩深染的核碎片，故有称之为嗜酸性小体（councilmanbodies）。生化特点：

由基因调控，是耗能的主动过程

Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶活化

DNA断裂以核小体为单位

DNA电泳呈阶梯状图谱TUNEL法检测凋亡（TerminalDeoxynucleotidylTransferase-mediateddUTPnick-end-labling）TdT介导的dUTP缺口末端标记TdT酶(TerminalDeoxynucleotidylTransferase)末端脱氧核苷酸转移酶（TUNEL）TUNEL法示意间接法：Digoxigenin-dUTPTUNEL染色：直接法参照德国宝灵曼公司原位末端标记试剂盒操作手册，其主要步骤如下：（1）切片脱蜡至水，双蒸水、PBS液洗；（2）微波处理：切片置于盛有枸椽酸缓冲液（0.01M，PH6.0）的容器中微波加热.（3）PBS液洗5min×3次；（4）每张切片滴加20ug／ml蛋白酶K液，放于湿盒中37℃孵育15min；（5）切片置于0.3%H2O2-甲醇液中室温放置20-25min；（6）滴加TUNEL反应混合液，37℃湿盒中孵育60-90min；

TUNEL反应混合液主要成分：Bio-11-dUTPTdT酶（7）PBS液洗5min×3次；（8）滴加链霉菌素—辣根过氧化物酶液（用PBS液稀释成1:200）37℃湿盒中孵育30min，（9）滴加新鲜配制的DAB-H2O2液，镜下观察2-10min显色；（10）自来水充分洗涤；免疫组化多重标记的应用以EnVision方法为例Forpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-2014免疫组化多重标记的应用在淋巴瘤研究中的应用ABC-DAB/SAB-AP-vectorblue示：CD30+H/RS细胞表达P53、BCL-22.ABC-DAB/SAB-AP-vectorred示：H/RS细胞、T细胞和B细胞的分布情况。3.TUNEL-DAB/SAB-AP-vectorred示:CD30+H/RS细胞4．免疫组织化学的质量控制及方案设计4．1．Ab的保存和配制保存性分装即用型配制：选最佳点4．2．正确的设计和结果判断1.试剂对照确定第一抗体和第二抗体是否具有抗原特异性。其中要确定第一抗体对阳性组织的最佳稀释度；第二抗体对组织蛋白的无反应性。阴性试剂对照：

用一个阴性试剂替代一抗或控制步骤目的：用来评价非特异性染色，并较好解释抗原部位的特异性标记。Forpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-20142.组织对照阴性组织对照：例如:正常肝组织用于对照HBsAg阳性的肝细胞检测再者,如果大规模使用抗体，一张切片的阴性区，可能就是另一张切片（不同Ab）的非特异性染色对照。阳性组织对照：有已知的、含目标抗原的样本目的：监控抗原是否存在；监控抗原敏感性是否丧失。组织内对照：可以消除不同组织间固定造成的差异，另一个优点是可以不使用阳性对照标本。

阴性试剂对照阴性组织对照阳性组织对照组织内对照研究组+--++-定位+/-+/-