2022-2023学年浙科版（2019）选择必修三 1.2纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得 课件（19张）

第二节纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得一、采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化1.单菌落分离通过平板划线法和稀释涂布平板法等方法获得单菌落意义：单菌落的分离是消除杂菌污染的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一.单菌落：在固体培养基上通过接种、培养获得的由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。平板划线法第1区划线接种环灭菌第2区划线接种环灭菌第3区划线接种环灭菌接种环灭菌12345分区划线法思考：若完成图示操作，共做了五次划线，接种环灼烧灭菌了几次？连续划线法

用接种环蘸菌液____次，在固体培养基表面划线，下一次划线应从上一次划线的______开始。每次划线前接种环要

，聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以在划线的末端出现不连续的

。若共划线五次，接种环要烧灼____次。另外：每次划线都不能与之前的线条_____；不能将最后一次划线与第一次划线相连；不能_____培养基。培养基需

后，放入培养箱培养。划破重叠6末端1例题灭菌单菌落

倒置注意：1.无论是何种划线法，蘸取菌种前和划线后，接种环都要灼烧灭菌。2.无论是何种划线法，菌种只蘸取一次。【注意事项】⑴接种环的灼烧：a.第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物。b.每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端。c.划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。⑷划线用力要大小适当，防止用力过大划破培养基。⑵灼烧接种之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种。⑶划线时最后一区域不要与第一区域相连。a.一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；b.存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。每次实验：划3个平板（重复实验）1个不接种（空白对照）1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长?如果有，说明了什么?提示：未接种的培养基是不能有菌生长的,如果有菌生,长则说明受到污染或者灭菌不彻底.2.如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗?原因：接种的菌种不纯、无菌操作不规范等。[结果分析与评价]3.你是如何记录实验结果的？

可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等稀释涂布平板法1.原理：用无菌水将菌液进行一系列的梯度稀释，在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的单菌落。2.过程：稀释菌液（10-5~10-7倍）涂布培养

用移液管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液，依次方法得到10-5~10-7倍稀释液。用移液管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h。分离、计数微生物——稀释涂布平板法无法计数1591720无法计数1411310无法计数15011319ml无菌水加入0.1ml稀释液（移液管）例：将1g土样加到盛有99ml无菌水的三角瓶中，如图进行稀释，每个稀释度涂布三个平板，根据结果计算1g土样中菌的数量？注意：1.分离得到单菌落一般以培养皿中有20个以内菌落为宜。2.计算微生物数量一般以培养皿中有30~300个菌落为宜。（159+141+150）÷3×10×105=1.5×108个/g稀释涂布平板法涂布分离：单菌落更易分开，可用于计数，但操作复杂。划线分离：方法简单，但单菌落较难分开，不能计数。1．目的要求(1)用平板划线法或____________________接种酵母菌。(2)用_________培养基大量扩增酵母菌。2．方法步骤(1)制作平板：对两个直径为90mm的培养皿进行_________，分别向其中倒入未凝固的固体培养基，使培养基铺满培养皿底部，厚度约2mm。标记：班级、姓名、日期、接种稀释度、LB或尿素。稀释涂布平板法液体标记二、活动：接种、培养并分离酵母菌(3)将菌种接种到液体培养基中。在无菌条件下用接种环将菌液接种到液体培养基中，同时以不接种菌液的液体培养基作为对照。(4)培养。将所有培养容器置于______℃下培养24h。(5)观察培养结果。获得__________后，可挑取菌落，并利用平板划线法接种至斜面培养基中。小思考：在划线操作时，如果接种环不慎划破培养基，可以继续正常进行操作吗？为什么？【答案】不能。因为划破培养基会造成划线不均匀，难以分离单菌落，可能导致微生物的无氧呼吸或杂菌污染。25单菌落

(2)接种方法二、采用稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量1.稀释涂布平板法可对微生物进行计数(2)原则：在保证能准确计数的前提下，减小稀释度。在实际操作中，适于计算的平板上菌落数的数目通常为30到300。统计的菌落数往往比活菌的实际数目要少，因为当两个或多个细胞，连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。(3)计数要求：在同一稀释度下涂布3个(或3个以上)平板，取平均值。(4)公式：每毫升菌液中微生物细胞的数量＝某一稀释倍数下至少3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。（1）原理：

当样品稀释度足够高时,平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。(1)原理：利用特定_________________，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。(2)方法：用血细胞计数板计数（显微镜计数法）。(3)显微镜下观察：血细胞计数板2.显微镜计数法可直接对菌液中的微生物进行计数计数微生物——显微镜计数法使用血细胞计数板的注意事项：1.先盖盖玻片再滴加菌液，让菌液自行渗入，多余的菌液用滤纸吸去。2.滴加菌液时避免菌液滴到盖玻片上，还要防止产生气泡。3.计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。4.对压线细胞计数时，数上不数下，数左不数右。5.为减小误差，应对同一红细胞计数区中的细胞进行3次计数后取平均值。6.血球计数板使用完后，用自来水冲洗，洗后自行晾干或用吹风机吹干。7.血细胞计数板计数时不能区分死菌和活菌。计数微生物——显微镜计数法影响实验结果的误差分析及改进办法

1.分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如下图所示。下列有关叙述错误的是(

)A.甲中a区域为划线的起始位置B.连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落C.接种过程中至少需要对接种环灼烧5次D.接种后将培养皿倒置并在适宜温度下培养A2.红细胞计数区由25×16=400个小方格组成,容纳液体的总体积为0.1mm3。现将1mL酵母菌样品加99mL无菌水稀释,用无菌吸管吸取少许摇匀的酵母菌悬液滴在盖玻片边缘,使其自行渗入计数区,并用滤纸吸去多余菌液。现观察到图中所示a、b、c、d、e5个中方格内共有酵母菌44个,则上述1mL酵母菌样品中约有菌体(

)A.2.2×108个 B.2.2×107个