流行性脑脊髓膜炎实验室诊断

流行性脑脊髓膜炎实验室诊断

天津市卫生防病中心病原生物学部井良义第1页，共34页。何谓流行性脑脊髓膜炎？流行性脑脊髓膜炎（简称流脑），是由脑膜炎奈瑟菌（Neisseriameningitides，Nm）通过呼吸道传播所引起的化脓性脑膜炎，常在冬春季节引起发病与流行,患者以儿童为多见，现在成年人发病有增多趋势。人受Nm感染后大多数表现为鼻咽部带菌状态，只有少数成为流脑患者。第2页，共34页。正常人群中Nm带菌率可达5～30%。，带菌者为流脑流行的重要传染源。细菌经飞沫传播，患者潜伏期1～4天，其发展经过可分为三期：

1.首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染，有时局部有炎症。

2.少数细菌侵入血流，造成单纯菌血症，可有突然发作的恶寒、发热、恶心、呕吐等，并可有出血性或红斑性皮疹，或称淤血点。

3.大量细菌侵入，由血液或淋巴到达脑脊髓膜，引起脑脊髓膜炎的症状与体征，如头痛、呕吐、颈项强直、发热等一般脑膜炎症状。

第3页，共34页。适宜的检测样品鼻咽拭子、血液、皮肤粘膜出血点挤出液、血清及脑脊液等。其中脑脊液、血液、皮肤粘膜出血点挤出液中检出脑膜炎奈瑟氏菌可直接作为确诊依据。第4页，共34页。样品采集与运送

第5页，共34页。样品采集（一）

脑脊液：无菌操作，吸出CSF3~5mL，立即放到无菌试管内离心(2000～3000r/min，30min)，用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到10％羊血巧克力色琼脂上(CSF上清液部分供检测Nm特异抗原，亦可将其置于－20℃待测)，5％二氧化碳环境37℃培养24～72h，每日检查细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定。第6页，共34页。样品采集（二）

血液：采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内注入4mL血液(余下的2mL血液同上离心后吸出血清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其置于一20℃待测)，同上述条件培养24~72h，每日进行分离培养。第7页，共34页。样品采集（三）淤血点：选病人皮肤上的新鲜淤血点或淤斑，消毒后用针头挑破，挤出组织液，用无菌棉签蘸取先接种含双抗的葡萄糖增菌肉汤管中增菌8~12h后分离培养或直接接种10％羊血巧克力色琼脂；涂片，干后革兰染色，直接镜检。第8页，共34页。样品采集（四）咽拭子：用长柄棉拭子采咽后壁两侧分泌物，立即接种卵黄双抗培养基或巧克力双抗平板，也可将咽拭子放入液体双抗增菌管内，增菌8~12h后分离培养。第9页，共34页。咽拭子接种第10页，共34页。咽拭子接种第11页，共34页。不合格咽拭子接种第12页，共34页。不合格咽拭子接种第13页，共34页。样品的处理和运送

早期采集样品：应尽可能采集病人用药前的早期样品，这可以明显提高病原的检出水平。及时处理样品：应尽可能地做到床边接种，若无可能则应在最短的时间内送到实验室进行接种培养。保温运送：应尽可能保持样品处于20~36℃之间，切记不能低温运送（检测抗体的血清标本除外）。第14页，共34页。流脑病原学检查方法

第15页，共34页。生长特性脑膜炎双球菌为专性需氧菌，初次分离时需5~10%的二氧化碳环境才能生长，最适生长温度为37℃。第16页，共34页。菌落特征及菌体形态菌落：Nm接种于巧克力色琼脂平皿上，5%CO2，37℃培养24小时后，其菌落直径约1mm，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。细菌形态：为革兰氏阴性，呈卵圆形和肾形，0.8×0.6大小。常成对排列，邻近两边扁平凹陷第17页，共34页。菌落特征第18页，共34页。菌落特征第19页，共34页。脑脊液涂片

第20页，共34页。生化特征分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。不分离蔗糖、果糖和乳糖。过氧化酶和氧化酶阳性

第21页，共34页。血清分群鉴定检查从病人分离的疑似Nm时，先用多价Ⅰ、多价Ⅱ、多价Ⅲ抗血清检测，如果阳性再用分群血清（A群、B群、C群、W135群抗血清等）检测。不与盐水发生凝集，与一种脑膜炎抗血清发生凝集反应，即为某一型的流脑菌。在盐水中发生凝集反应，不能作为抗血清分群。第22页，共34页。菌种保存

短期保存：保存脑膜炎双球菌，用卵黄盐水保存，可保存7天。2长期保存：最好方法是低温冷冻或冷冻干燥。所有的细菌都可在-70℃冰箱中冷冻保存。将脑膜炎双球菌接种巧克力平板中，放二氧化碳培养箱中35～37℃孵育18～20小时，收集细菌放到含1ml脱脂牛奶的2ml螺盖冷冻瓶中。将菌苔在管壁研磨振荡，使细菌分散在培养基中。-70℃低温冰箱分类保存。第23页，共34页。流脑血清学检查方法（一）

玻片凝集试验:应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。

Nm诊断血清：国产售品有多价Ⅰ（包含A、B、C、D群），多价Ⅱ[含1889（Y）、1890（H）、1892（29E）]，多价Ⅲ[含319（W135）、1916（X）、1486（I）、1811（K）群]及各群单价血清，共计14种。（括号内为国际编码）第24页，共34页。流脑血清学检查方法（二）酶联免疫吸附试验（ELISA）：应用ELISA间接法测病人急性期和恢复期血清中抗A群流脑IgG的抗体水平。此方法也可以应用于健康者血清抗体的测定。若病人恢复期血清抗体效价较急性期呈现4或4倍以上升高有追溯诊断的意义。第25页，共34页。流脑血清学检查方法（三）杀菌力试验：应用微量杀菌力试验(TTC法)测定病人急性期和恢复期血清中对Nm的杀菌抗体水平。此方法也可用于健康人群的血清抗体测定。

第26页，共34页。流脑其它检查方法（一）胶乳凝集试验应用胶乳凝集实验测定病人CSF、急性期血清和尿中Nm群特异抗原，辅助流脑临床诊断。可用市售的脑膜炎乳胶凝集试剂盒（如法国梅里埃公司的试剂盒）。方法：一滴乳胶试剂（30μl）加上一滴病人的脑脊液，涂匀，在2分钟内出现明显凝集者为阳性。第27页，共34页。流脑其它检查方法（二）

PCR检测：应用PCR检查病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，对流脑病人进行早期诊断。

第28页，共34页。培养基制备巧克力色血液琼脂：

成份：营养琼脂（pH7.6）100ml

脱纤维血5~10ml

制法：将营养琼脂溶解，以无菌手续加入羊血，摇匀。置水浴锅内，维持在90℃20~30min。待培养基冷至50℃时才倾注平板。如做病人密切接触者或健康人群带菌调查时，则需加双抗，每1000ml培养基加入多粘菌素4.2mg（或2.5万单位），万古霉素3.3mg。

第29页，共34页。卵黄盐水将新鲜鸡蛋洗净，在70%酒精中浸泡消毒1h后取出，用3%碘酒消毒蛋壳，以无菌操作于鸡蛋的一端开一小孔，使蛋清全部流尽，蛋黄倒入置有玻璃珠的三个烧瓶中，打碎后，一份蛋黄加一份生理盐水，再在摇珠瓶中振摇，使其混匀呈乳状分装试管，56℃加温30min，置37℃作无菌试验。（脑膜炎双球菌保菌用）第30页，共34页。增菌肉汤成份：新鲜牛肉汤100ml葡萄糖0.5g

配制：混合上述成份，调pH至7.4~7.6分装试管，2ml/管或30ml/瓶，高压灭菌10磅10分钟，无菌检验合格后供增菌用。第31页，共34页。诊断试剂1、诊断血清：中国CDC传控所呼吸道细菌室流脑组（北京昌平流字五号）或中国药品生物制品检定所（天坛西里2号）。

2、巧克力平板：自制或市售。

3、多粘菌素或万古霉素：北京陆桥技术有限责任公司有售。

4、胶乳凝集试剂盒：法国梅里埃公司有乳胶凝集法脑膜炎检测试剂盒。可测定A群、B群及C群流脑，所用材料为病人脑脊液。第32页，共34页。谢谢

第33页，共34页。内容梗概流行性脑脊髓膜炎实验室诊断。及时处理样品：应尽可能地做到床边接种，若无可能则应在最短的时间内送到实验室进行接种培养。保温运送：应尽可能保持样品处于20~36℃之间，切记不能低温运送（检测抗体的血清标本除外）。细菌形态：为革兰氏阴性，呈卵圆形和肾形，0.8×0.6大小。将菌苔在管壁研磨振荡，使细菌分散在培养基中。玻片凝集试验:应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。若病人恢复期血清抗体效价较急性期呈现4或4倍以上升高有追溯诊断的意义。杀菌力试验：应用微量杀菌力试验(TTC法)测定病人急性期和恢复期血清中对Nm的杀菌抗体水平。胶乳凝集试验应用胶乳凝集实验测定病人CSF、急性期血清和尿中Nm群特异抗原，辅助流