分子发光光谱法课件

第五章分子发光光谱法第五章分子发光光谱法1某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法。较高激发态基态吸收能量受激光辐射退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量§5.1概述一、分子发光分析法及其分类某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐2根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：光致发光：以光源来激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法生物发光：以生物体释放的能量激发而发光荧光—荧光分析法磷光—磷光分析法根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：荧光3二、分子荧光分析法的特点1.灵敏度高荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度

采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低2~4个数量级激发发射荧光强强激发光物质二、分子荧光分析法的特点1.灵敏度高采用高42.选择性好不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3.实验方法简单4.待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法2.选择性好5§5.2分子荧光和磷光的基本原理一、荧光和磷光的产生

激发态分子在跃迁回到基态的过程中将多余的能量以光子形式辐射出来，这种现象称为“发光”激发单重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中不发生自旋方向的变化。用S0、S1、S2分别表示分子的基态、第一和第二激发单重态。§5.2分子荧光和磷光的基本原理一、荧光和磷光的产生6激发三重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中伴随着电子自旋方向的变化。用T1、T2分别表示分子第一和第二激发三重态。激发三重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中伴随着电子自旋方向的71.振动弛豫:

它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转移至低振动能级的无辐射跃迁过程。2.内转换:

是指两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迂过程。3.系间跨越:不同多重态间的无辐射跃迁，同时伴随着受激电子自旋状态的改变，如S1→T1。4.外转换：激发分子通过与溶剂或其他溶质分子间的相互作用使能量转换，而使荧光或磷光强度减弱或消失的过程。这一现象又称为“熄灭”或“淬灭”。1.振动弛豫:它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转8S0S0S1S2T1λ2吸光内转换系间跨跃λ1吸光λ3荧光外转换λ4磷光振动驰豫S0S0S1S2T1λ2内转换系间跨跃λ1λ3外转换9荧光发射：当分子处在单重态的最低振动能层时，去激发过程是以10-7～10-9s左右的时间内发射一个光子回到基态。磷光发射：激发态分子经过系间跨跃到激发三重态后，并经过迅速的振动驰豫到达第一激发三重态（T1）的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子返回基态。磷光的寿命比荧光的要长得多荧光发射：当分子处在单重态的最低振动能层时，去激发过程是以110从图中看出磷＞荧＞

激*易产生荧光

n*易产生磷光从图中看出11二、激发光谱和发射光谱

固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波长，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系作图，得到激发光谱曲线。

选择最大激发波长作为激发光波长，然后测定不同发射波长时所发射的荧光或磷光强度，得到荧光或磷光光谱曲线。二、激发光谱和发射光谱固定荧光的最大发射波长，12分子发光光谱法课件13三、分子荧光参数1．量子产率又称荧光效率

物质分子的荧光产率必然由激发态分子之活化过程的各个相对速率决定：三、分子荧光参数1．量子产率又称荧光效率物142．荧光寿命

荧光寿命是指停止激发之后，荧光强度降到最大强度的1/e所需要的时间，常用τ表示。I0，It分别表示在时间0和t时的荧光强度。利用荧光寿命，可以进行荧光混合物分析。2．荧光寿命荧光寿命是指停止激发之后，荧光强15物质只有吸收了紫外可见光，产生*n*跃迁，产生荧光*与n*跃迁相比，摩尔吸收系数大，寿命短*跃迁常产生较强的荧光，n*跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物是最强最有用的荧光体三、荧光与分子结构的关系物质只有吸收了紫外可见光，产生*n*跃迁16具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强fex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲线状环结构比非线状结构的荧光波长长1.共轭体系——有较强的荧光具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产17

芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定

3，4-苯并芘是强致癌物ex=386nm

em=430nm芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光182.刚性平面结构———较稳定的平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质2.刚性平面结构———较稳定的平面结构具有强荧光的分子多19例1，2-二苯乙烯反式：平面构型强荧光体顺式：非平面构型非荧光体例1，2-二苯乙烯反式：平面构型203.金属螯合物的荧光大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强3.金属螯合物的荧光大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，214.取代基的类型对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：（1）增强荧光的取代基

——有-OH、-OR、-NH2、

-NHR、-NR2等给电子基团由于基团的n

电子（孤对电子）的电子云与苯环上的

轨道平行，共享了共轭电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强4.取代基的类型对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分22（2）减弱荧光的取代基

——-COOH、-NO2

、-COOR、

-NO、-SH

吸电子基团,使荧光波长短移，荧光强度减弱（3）影响不明显的取代基

——-NH3+、-R、-SO3H等

(4)芳环上被F、Cl、Br、I

取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。

(5)取代基位置——对位、邻位取代增强荧光，间位取代抑制荧光。（2）减弱荧光的取代基——-COOH、-NO2、-C23四、环境对荧光、磷光的影响1.溶剂的影响

同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质，一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大2.温度的影响——低温下测定，提高灵敏度因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度对磷光影响更大四、环境对荧光、磷光的影响1.溶剂的影响2.温243.pH的影响大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大。共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。例：苯酚离子化后，荧光消失pH≈1有荧光pH≈13无荧光3.pH的影响大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光25但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光例：—苯酚有荧光无荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性。但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，264.荧光猝灭（荧光熄灭）——荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂(i)碰撞熄灭碰撞熄灭是荧光熄灭的主要原因。它是指处于激发单重态的荧光分子M*与熄灭剂Q相互碰撞后，激发态分子以无辐射跃迁的方式返回基态，产生熄灭作用。碰撞熄灭将随温度的升高而增加；将随溶液黏度的减小而增大。4.荧光猝灭（荧光熄灭）——荧光物质分子与溶剂分子或其他溶27

（ⅱ）能量转移它是指处于激发单重态的荧光分子M*与熄灭剂相互作用后，发生能量转移，使熄灭剂得到激发，其反应如下(ⅲ)组成化合物的熄灭它是指熄灭剂和荧光分子在基态时发生配合反应，生成不发荧光的配合物。（ⅱ）能量转移它是指处于激发单重态的荧光分子M*与28(ⅳ)自熄灭和自吸收当荧光物质浓度较大时，常会发生自熄灭现象，这可能由于激发态分子之间的碰撞引起能量损失。假如荧光物质的吸收光谱和发射光谱有较大的重叠，由荧光物质发射的荧光，有一部分可能会被它自身的基态分子所吸收，这种现象称为自吸收。随荧光物质浓度的增加，自吸收现象将会加剧。(ⅳ)自熄灭和自吸收当荧光物质浓度较大时，常会发29五、荧光强度与荧光物质浓度的关系用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If

用仪器测得，在荧光浓度很稀(A<0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系If=fIa=f（I0-I）Ia为吸收的辐射强度I0为入射光强度荧光池I0IIf荧光强度检测器If=f（I0-I010-A

）

=fI0

（1-10-A

）I=I010-A将上式展开五、荧光强度与荧光物质浓度的关系用强度为I0的入射光，照射到30当A﹤0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化If=2.3fI0A=2.3fI0bc当A﹤0.05时，

If与f、I0、和c有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，f、I0、和b为常数，合并为K

If=KCIp=KC定量分析依据当A﹤0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上31荧光强度与物质浓度呈线形关系，If=KC只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高。浓度高时，If与C不呈线形关系，有时C增大，If反而降低因为公式[]中后面影响，有时发生荧光猝灭效应。荧光强度与物质浓度呈线形关系，If=KC只有在浓度低时使用，32（一）荧光分析仪器——主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成光源第一单色器液池第二单色器检测器放大器及记录器exem与分光光度计有两点不同①两个单色器②检测器与激发光互成直角I0§5.3荧光和磷光分析仪（一）荧光分析仪器——主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示331、光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源1、光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；342、单色器

大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长

ex

，用此激发光激发液池内的荧光物质

ex。第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长

em。在选定的

em

下测定荧光强度，定量分析。2、单色器大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较353、样品池盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边。4、检测器把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度3、样品池盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，36（二）磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.试样室试样需在液氮温度（77K，-196℃）下测定低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）固体表面室温磷光分析需特制试样室2.磷光镜有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。（二）磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：37（一）定量分析方法定量分析依据If=KCIp=KC1.标准曲线法——最常用的定量分析方法将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标§5.4荧光和磷光分析及其应用（一）定量分析方法§5.4荧光和磷光分析及其应用382.荧光猝灭法把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性若荧光物质M与猝灭剂Q生成不发荧光的基态配合物MQM+Q=MQ（非荧光物质）经推导得出：猝灭剂加入前的荧光强度猝灭剂加入后试液的荧光强度常数猝灭剂浓度I前/I后与C（Q）有线性关系，可求猝灭剂含量2.荧光猝灭法把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和39与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂Q，配成一个荧光物质—猝灭剂体系，然后在相同条件下测定它们的荧光强度，得一曲线取相同荧光物质CMCMCMCM

…

CM

加不同量QCQ0CQ1CQ2CQ3…

CQx(CQ0=0)

测IfI前

I后1I后2I后3

…I后

x

计算I前/I后I前/I后1I前/I后2I前/I后3

…

I前/I后x

CQxCQI前/I后xI前/I后与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入一系列不同量403.比较法——比较简单如果试样数量不多，可用比较法进行测量配一标准溶液浓度为Cs，Cs与未知液浓度Cx相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度未知液If

x=KCx

标准液If

s=KCs

比较3.比较法——比较简单如果试样数量不多，可用比较法进行测量414.多组分混合物的荧光分析(1)如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定可分别在各自的荧波长处测定,求出它们的含量(2)如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光;可选用不同的激发光进行测定4.多组分混合物的荧光分析(1)如果两组分的荧光峰相互不42Al3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=365nm

em=520nmGa3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=436nm

em=520nm365nm激发光，Al3+的配合物产生荧光，而Ga3+配合物不产生荧光，无荧光峰；

436nm激发光，Ga3+

的配合物产生荧光，而Al3+配合物不产生荧光，无荧光峰在365nm条件下激发，520nm处测Al3+—8-羟基喹啉配合物，在436nm条件下激发，520nm处测Ga3+—8-羟基喹啉配合物例：Al3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液例：43(3)如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰利用荧光强度的加和性（F=F1+F2+F3+…），在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解例：硫胺荧CT

ex=385nm

em=435nm

吡啶硫胺荧CP

ex=410nm

em=480nm相互干扰荧光光谱重叠在385或410nm下激发，在435和480nm下分别测荧光强度(3)如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰利用荧光强度的44在385或410nm下激发，在435和480nm下分别测荧光强度If435/385=26339104CT+210104CPIf480/385=9685104CT+1022104CPIf480/410=2816104CT+1709104CPIf435/410=6419104CT+252104CP硫胺素浓度吡啶硫胺素浓度If=KC——K:纯物质在选定波长下测If,求K385nm激发或410nm激发在385或410nm下激发，在435和480nm下分别测荧光45（二）荧光分析法的应用荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点1.无机化合物的分析无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达70多种，其中较常采用荧光法测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素能够同金属离子形成荧光配合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物，形成五元环或六元环的螯合物，分子的刚性平面结构增大，变为强荧光体荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等（二）荧光分析法的应用荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点462.有机化合物的分析脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的测定方法2.有机化合物的分析脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本47为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进48例：3，4–苯并芘3，4–苯并芘为强致癌物质煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧垃圾都会产生3，4–

苯并芘，汽车尾气也是主要来源食品加工过程也会产生3，4–

苯并芘，尤其是烟熏、油炸、烘烤食品分析测定：用环己烷将3，4–

苯并芘从试样中提取出来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色谱法分离纯化，用95%C2H5OH稀释，用荧光分光光度计测定相对荧光强度进行定量例：3，4–苯并芘3，4–苯并芘为强致癌物质煤炭、石49例：VB2——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于强酸或强碱性溶液。在低浓度情况下，I=KC，I与C呈线性关系，在pH6~7荧光最强在430~440nm蓝光照射下，发出绿色荧光，em=535nm下测I，用标准曲线法测定缺VB2会得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮维生素B2例：VB2——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝50（三）磷光分析法应用能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到一定的应用。低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃及含O、S、N的杂环化合物分析固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。（三）磷光分析法应用能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧51§5.5化学发光分析法一、概述化学发光是利用化学反应所产生的能量，使其中一种产物的分子的电子被激发成激发态分子，当其返回基态时发射一定波长的光而建立的分析方法。化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的能量来源不同，需要化学反应过程中所提供的化学能§5.5化学发光分析法一、概述52化学发光分析具有以下特点灵敏度高——例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATP的化学发光反应，可测定低至2×10-17mol·L-1ATP线性范围宽——一般有5~6个数量级仪器设备简单，成本低廉分析速度快，易实现自动化局限性：可供发光用的试剂有限发光机理有待进一步研究化学发光分析具有以下特点灵敏度高——例：用荧光素酶和三磷酸腺53二、化学发光分析的基本原理（一）化学发光反应的基本条件发光反应必须满足以下条件1.化学反应必须产生足够的化学能化学发光基于化学反应提供足够的能量。在可见光区观察化学发光，需170~300kJ·mol-1激发能，具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求，化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应中。2.处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态。二、化学发光分析的基本原理（一）化学发光反应的基本条件54（二）化学发光效率和发光强度化学发光效率CL激发态分子的化学效率激发态分子的发光效率r取决于发光所依据的化学反应本身f与荧光效率的影响因素相同，既取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响（二）化学发光效率和发光强度化学发光效率CL激发态分子的化55化学发光强度具有高效率的化学发光是生物体中亦称生物发光。如：萤火虫发光反应的效率几乎接近100%。非生物体的化学发光效率一般不超过1%化学发光强度ICL（t）与反应速度、化学发光效率有如下关系对下列化学发光反应A+B→C*+D

C+hICL随时间和反应物消耗的变化逐渐减小化学发光强度具有高效率的化学发光是生物体中亦称生物发光。如：56A+B→C*+DA为待测物质，C为发光物质，当反应物B的浓度远远过量于待测物浓度时，B的浓度可认为是常数。因此，发光反应可视为一级反应t时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。常用发光总强度来定量分析发光总强度A57三、化学发光反应的类型1.液相化学发光——研究和应用的比较广泛的有鲁米诺（Luminol）光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定Cl2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，产生化学发光反应时量子效率为0.01~0.05鲁米诺（3–氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中和H2O2等氧化剂反应生成最大波长为425nm的光辐射三、化学发光反应的类型1.液相化学发光58氧化剂425nm

反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光可检测低至10-9mol·L-1

的H2O2氧化剂425nm反应产生的化学能被产物氨基59鲁米诺H2O2的化学反应，可以被一些痕量的过渡金属元素所催化，使发出的光大大增强，由此可测定Co（Ⅱ）,Cu（Ⅱ）,Ni（Ⅱ）,Cr（Ⅲ），Fe（ⅡⅢ

），Ag（Ⅰ），Au（Ⅲ

），Mn(Ⅱ)，Hg（Ⅱ

）Os（ⅢⅣⅤ），Ru（Ⅵ），V（Ⅳ），Ir（Ⅳ）等金属离子，检测限由0.01~40g·mL-1不等利用鲁米诺发光体系可以测定50余种元素和大量有机和无机化合物，灵敏度都比较高鲁米诺化学发光体系还可用于许多生化反应研究，常常涉及到H2O2的产生或H2O2参加反应鲁米诺H2O2的化学反应，可以被一些痕量的过渡金属元素所催化602.气相化学发光——广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的O3；NO、NO2；SO2；H2S；CO；乙烯等。在气相中O3能氧化NO、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化NO、SO2、CO等产生化学发光例：NO+O3→NO2*+O2NO2*→NO2+h

（≥600nm）常温下产生化学发光，灵敏度可达1ng·mL-1测定范围0.01~10000g·mL-1

CO+O（原子氧）→CO2*CO2*→CO2+h

（=300~500nm）灵敏度为1ng·mL-12.气相化学发光——广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的O61四、化学发光分析仪器（自学）气相化学发光反应主要用于某些气体的监测，有专用的监测仪。主要讨论的是液相发光分析仪器按进样方式分立取样式和流动注射式化学发光仪1.分立取样式——是一种在静态下测量发光信号的装置，它利用移液管或注射器取一定量的试剂与试样加入发光反应池中混合，或把试剂与试样加入贮液管中，开启塞子使溶液流入反应池中混合，化学发光反应立即发生，发光信号通过光电倍增管检测，记录下发光强度。根据发光峰面积的积分值或峰高进行定量分析仪器具有设备简单，造价低，体积小，灵敏度高等优点缺点：手工进样重复性差，测定精密度不高；难以实现自动化，分析效率低四、化学发光分析仪器（自学）气相化学发光反应主要用于某些气体62分子发光光谱法课件632.流动注射式——是动态测量法，试液和试剂通过蠕动泵传送，并在流动中进样混合，恰好流动至盘管中反应发光，流动注射式发光分析的自动化程度、精密度和准确度都比较高，分析速度快，适用于批量试样的测定2.流动注射式——是动态测量法，试液和试剂通过蠕动泵传送，64分子发光光谱法课件65分子发光光谱法课件66第五章分子发光光谱法第五章分子发光光谱法67某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法。较高激发态基态吸收能量受激光辐射退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量§5.1概述一、分子发光分析法及其分类某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐68根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：光致发光：以光源来激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法生物发光：以生物体释放的能量激发而发光荧光—荧光分析法磷光—磷光分析法根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：荧光69二、分子荧光分析法的特点1.灵敏度高荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度

采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低2~4个数量级激发发射荧光强强激发光物质二、分子荧光分析法的特点1.灵敏度高采用高702.选择性好不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3.实验方法简单4.待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法2.选择性好71§5.2分子荧光和磷光的基本原理一、荧光和磷光的产生

激发态分子在跃迁回到基态的过程中将多余的能量以光子形式辐射出来，这种现象称为“发光”激发单重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中不发生自旋方向的变化。用S0、S1、S2分别表示分子的基态、第一和第二激发单重态。§5.2分子荧光和磷光的基本原理一、荧光和磷光的产生72激发三重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中伴随着电子自旋方向的变化。用T1、T2分别表示分子第一和第二激发三重态。激发三重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中伴随着电子自旋方向的731.振动弛豫:

它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转移至低振动能级的无辐射跃迁过程。2.内转换:

是指两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迂过程。3.系间跨越:不同多重态间的无辐射跃迁，同时伴随着受激电子自旋状态的改变，如S1→T1。4.外转换：激发分子通过与溶剂或其他溶质分子间的相互作用使能量转换，而使荧光或磷光强度减弱或消失的过程。这一现象又称为“熄灭”或“淬灭”。1.振动弛豫:它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转74S0S0S1S2T1λ2吸光内转换系间跨跃λ1吸光λ3荧光外转换λ4磷光振动驰豫S0S0S1S2T1λ2内转换系间跨跃λ1λ3外转换75荧光发射：当分子处在单重态的最低振动能层时，去激发过程是以10-7～10-9s左右的时间内发射一个光子回到基态。磷光发射：激发态分子经过系间跨跃到激发三重态后，并经过迅速的振动驰豫到达第一激发三重态（T1）的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子返回基态。磷光的寿命比荧光的要长得多荧光发射：当分子处在单重态的最低振动能层时，去激发过程是以176从图中看出磷＞荧＞

激*易产生荧光

n*易产生磷光从图中看出77二、激发光谱和发射光谱

固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波长，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系作图，得到激发光谱曲线。

选择最大激发波长作为激发光波长，然后测定不同发射波长时所发射的荧光或磷光强度，得到荧光或磷光光谱曲线。二、激发光谱和发射光谱固定荧光的最大发射波长，78分子发光光谱法课件79三、分子荧光参数1．量子产率又称荧光效率

物质分子的荧光产率必然由激发态分子之活化过程的各个相对速率决定：三、分子荧光参数1．量子产率又称荧光效率物802．荧光寿命

荧光寿命是指停止激发之后，荧光强度降到最大强度的1/e所需要的时间，常用τ表示。I0，It分别表示在时间0和t时的荧光强度。利用荧光寿命，可以进行荧光混合物分析。2．荧光寿命荧光寿命是指停止激发之后，荧光强81物质只有吸收了紫外可见光，产生*n*跃迁，产生荧光*与n*跃迁相比，摩尔吸收系数大，寿命短*跃迁常产生较强的荧光，n*跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物是最强最有用的荧光体三、荧光与分子结构的关系物质只有吸收了紫外可见光，产生*n*跃迁82具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强fex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲线状环结构比非线状结构的荧光波长长1.共轭体系——有较强的荧光具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产83

芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定

3，4-苯并芘是强致癌物ex=386nm

em=430nm芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光842.刚性平面结构———较稳定的平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质2.刚性平面结构———较稳定的平面结构具有强荧光的分子多85例1，2-二苯乙烯反式：平面构型强荧光体顺式：非平面构型非荧光体例1，2-二苯乙烯反式：平面构型863.金属螯合物的荧光大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强3.金属螯合物的荧光大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，874.取代基的类型对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：（1）增强荧光的取代基

——有-OH、-OR、-NH2、

-NHR、-NR2等给电子基团由于基团的n

电子（孤对电子）的电子云与苯环上的

轨道平行，共享了共轭电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强4.取代基的类型对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分88（2）减弱荧光的取代基

——-COOH、-NO2

、-COOR、

-NO、-SH

吸电子基团,使荧光波长短移，荧光强度减弱（3）影响不明显的取代基

——-NH3+、-R、-SO3H等

(4)芳环上被F、Cl、Br、I

取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。

(5)取代基位置——对位、邻位取代增强荧光，间位取代抑制荧光。（2）减弱荧光的取代基——-COOH、-NO2、-C89四、环境对荧光、磷光的影响1.溶剂的影响

同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质，一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大2.温度的影响——低温下测定，提高灵敏度因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度对磷光影响更大四、环境对荧光、磷光的影响1.溶剂的影响2.温903.pH的影响大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大。共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。例：苯酚离子化后，荧光消失pH≈1有荧光pH≈13无荧光3.pH的影响大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光91但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光例：—苯酚有荧光无荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性。但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，924.荧光猝灭（荧光熄灭）——荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂(i)碰撞熄灭碰撞熄灭是荧光熄灭的主要原因。它是指处于激发单重态的荧光分子M*与熄灭剂Q相互碰撞后，激发态分子以无辐射跃迁的方式返回基态，产生熄灭作用。碰撞熄灭将随温度的升高而增加；将随溶液黏度的减小而增大。4.荧光猝灭（荧光熄灭）——荧光物质分子与溶剂分子或其他溶93

（ⅱ）能量转移它是指处于激发单重态的荧光分子M*与熄灭剂相互作用后，发生能量转移，使熄灭剂得到激发，其反应如下(ⅲ)组成化合物的熄灭它是指熄灭剂和荧光分子在基态时发生配合反应，生成不发荧光的配合物。（ⅱ）能量转移它是指处于激发单重态的荧光分子M*与94(ⅳ)自熄灭和自吸收当荧光物质浓度较大时，常会发生自熄灭现象，这可能由于激发态分子之间的碰撞引起能量损失。假如荧光物质的吸收光谱和发射光谱有较大的重叠，由荧光物质发射的荧光，有一部分可能会被它自身的基态分子所吸收，这种现象称为自吸收。随荧光物质浓度的增加，自吸收现象将会加剧。(ⅳ)自熄灭和自吸收当荧光物质浓度较大时，常会发95五、荧光强度与荧光物质浓度的关系用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If

用仪器测得，在荧光浓度很稀(A<0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系If=fIa=f（I0-I）Ia为吸收的辐射强度I0为入射光强度荧光池I0IIf荧光强度检测器If=f（I0-I010-A

）

=fI0

（1-10-A

）I=I010-A将上式展开五、荧光强度与荧光物质浓度的关系用强度为I0的入射光，照射到96当A﹤0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化If=2.3fI0A=2.3fI0bc当A﹤0.05时，

If与f、I0、和c有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，f、I0、和b为常数，合并为K

If=KCIp=KC定量分析依据当A﹤0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上97荧光强度与物质浓度呈线形关系，If=KC只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高。浓度高时，If与C不呈线形关系，有时C增大，If反而降低因为公式[]中后面影响，有时发生荧光猝灭效应。荧光强度与物质浓度呈线形关系，If=KC只有在浓度低时使用，98（一）荧光分析仪器——主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成光源第一单色器液池第二单色器检测器放大器及记录器exem与分光光度计有两点不同①两个单色器②检测器与激发光互成直角I0§5.3荧光和磷光分析仪（一）荧光分析仪器——主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示991、光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源1、光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；1002、单色器

大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长

ex

，用此激发光激发液池内的荧光物质

ex。第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长

em。在选定的

em

下测定荧光强度，定量分析。2、单色器大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较1013、样品池盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边。4、检测器把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度3、样品池盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，102（二）磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.试样室试样需在液氮温度（77K，-196℃）下测定低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）固体表面室温磷光分析需特制试样室2.磷光镜有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。（二）磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：103（一）定量分析方法定量分析依据If=KCIp=KC1.标准曲线法——最常用的定量分析方法将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标§5.4荧光和磷光分析及其应用（一）定量分析方法§5.4荧光和磷光分析及其应用1042.荧光猝灭法把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性若荧光物质M与猝灭剂Q生成不发荧光的基态配合物MQM+Q=MQ（非荧光物质）经推导得出：猝灭剂加入前的荧光强度猝灭剂加入后试液的荧光强度常数猝灭剂浓度I前/I后与C（Q）有线性关系，可求猝灭剂含量2.荧光猝灭法把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和105与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂Q，配成一个荧光物质—猝灭剂体系，然后在相同条件下测定它们的荧光强度，得一曲线取相同荧光物质CMCMCMCM

…

CM

加不同量QCQ0CQ1CQ2CQ3…

CQx(CQ0=0)

测IfI前

I后1I后2I后3

…I后

x

计算I前/I后I前/I后1I前/I后2I前/I后3

…

I前/I后x

CQxCQI前/I后xI前/I后与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入一系列不同量1063.比较法——比较简单如果试样数量不多，可用比较法进行测量配一标准溶液浓度为Cs，Cs与未知液浓度Cx相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度未知液If

x=KCx

标准液If

s=KCs

比较3.比较法——比较简单如果试样数量不多，可用比较法进行测量1074.多组分混合物的荧光分析(1)如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定可分别在各自的荧波长处测定,求出它们的含量(2)如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光;可选用不同的激发光进行测定4.多组分混合物的荧光分析(1)如果两组分的荧光峰相互不108Al3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=365nm

em=520nmGa3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=436nm

em=520nm365nm激发光，Al3+的配合物产生荧光，而Ga3+配合物不产生荧光，无荧光峰；

436nm激发光，Ga3+

的配合物产生荧光，而Al3+配合物不产生荧光，无荧光峰在365nm条件下激发，520nm处测Al3+—8-羟基喹啉配合物，在436nm条件下激发，520nm处测Ga3+—8-羟基喹啉配合物例：Al3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液例：109(3)如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰利用荧光强度的加和性（F=F1+F2+F3+…），在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解例：硫胺荧CT

ex=385nm

em=435nm

吡啶硫胺荧CP

ex=410nm

em=480nm相互干扰荧光光谱重叠在385或410nm下激发，在435和480nm下分别测荧光强度(3)如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰利用荧光强度的110在385或410nm下激发，在435和480nm下分别测荧光强度If435/385=26339104CT+210104CPIf480/385=9685104CT+1022104CPIf480/410=2816104CT+1709104CPIf435/410=6419104CT+252104CP硫胺素浓度吡啶硫胺素浓度If=KC——K:纯物质在选定波长下测If,求K385nm激发或410nm激发在385或410nm下激发，在435和480nm下分别测荧光111（二）荧光分析法的应用荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点1.无机化合物的分析无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达70多种，其中较常采用荧光法测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素能够同金属离子形成荧光配合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物，形成五元环或六元环的螯合物，分子的刚性平面结构增大，变为强荧光体荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等（二）荧光分析法的应用荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点1122.有机化合物的分析脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的测定方法2.有机化合物的分析脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本113为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进114例：3，4–苯并芘3，4–苯并芘为强致癌物质煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧垃圾都会产生3，4–

苯并芘，汽车尾气也是主要来源食品加工过程也会产生3，4–

苯并芘，尤其是烟熏、油炸、烘烤食品分析测定：用环己烷将3，4–

苯并芘从试样中提取出来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色谱法分离纯化，用95%C2H5OH稀释，用荧光分光光度计测定相对荧光强度进行定量例：3，4–苯并芘3，4–苯并芘为强致癌物质煤炭、石115例：VB2——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于强酸或强碱性溶液。在低浓度情况下，I=KC，I与C呈线性关系，在pH6~7荧光最强在430~440nm蓝光照射下，发出绿色荧光，em=535nm下测I，用标准曲线法测定缺VB2会得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮维生素B2例：VB2——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝116（三）磷光分析法应用能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到一定的应用。低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃及含O、S、N的杂环化合物分析固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。（三）磷光分析法应用能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧117§5.5化学发光分析法一、概述化学发光是利用化学反应所产生的能量，使其中一种产物的分子的电子被激发成激发态分子，当其返回基态时发射一定波长的光而建立的分析方法。化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的能量来源不同，需要化学反应过程中所提供的化学能§5.5化学发光分析法一、概述118化学发光分析具有以下特点灵敏度高——例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATP的化学发光反应，可测定低至2×10-17mol·L-1ATP线性范围宽——一般有5~6个数量级仪器设备简单，成本低廉分析速度快，易实现自动化局限性：可供发光用的试剂有限