聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质

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聚丙烯酰胺凝胶电泳

分离血清蛋白质

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8，AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。实验原理TEMED（加速剂）过硫酸铵硫酸根自由基（催化剂）

Acr（双链）Acr（长链）+Bis(交联剂)

PAG凝胶

聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）浓缩效应（四个不连续性形成）分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）不连续体系由凝胶层、缓冲液离子成分、电位梯度、pH因素所组成。浓缩胶是大孔径，分离胶是小孔径；Cl-为快离子、甘氨酸根离子为慢离子、Tris为缓冲配对离子,Cl->Pr>Gly-;浓缩胶缓冲液为pH6.7，分离胶缓冲液为pH8.9；电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液;电位梯度的差异是自动形成的，在快离子与慢离子之间形成电位梯度，由于Pr的有效迁移率介于快慢离子之间故也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成狭小的中间层；2种孔径的凝胶、3种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了，样品得到浓缩。

样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)

尾随离子或慢离子：甘氨酸根当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性：分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。电荷效应 电荷量不同，迁移率不同。实验仪器

电泳装置稳压电源盘状电泳槽

刻度吸量管

玻璃管和橡胶帽

培养皿

微量移液器

脱色摇床

注射器和长针头实验试剂丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)Acr的重结晶Bis重结晶（注意固体Acr和Bis应贮存应贮存棕色瓶中，在干燥、低温和暗处保存，并注意避免超声波、γ-辐射和自然光的照射）

TEMED-四甲基乙二胺，避免冰箱保存。过硫酸铵(不能潮解，否则不能用)

染色液：用0.05NNaOH配制0.1％溴酚兰液洗脱液：7％醋酸其他试剂：见下表贮存液的配制。按表1配制各贮存液置冰箱中贮存，可放1—2月（但过硫酸铵液贮存冰箱不能超过一周）。贮存液100ml溶液中的含量pH工作溶液配制的体积比11NHCl48.0mlTris36.6克TEMED0.23ml8.9分离胶制备：1份1号，2份2号，1份水；抽气后加入4份3号凝胶浓度7％pH8.92Acr28.0克Bis0.725克3过硫酸铵0.14克41NHCl48.0mlTris5.98克TEMED0.46ml6.7浓缩胶制备：1份4号，2份5号抽气后加入4份6号凝胶浓度2.5％pH6.75Acr10.0克Bis2.5克6蔗糖40.0克7电泳槽缓冲液：Tris0.60克甘氨酸2.88克8.3用时可稀释10倍500ml可供12根电泳管实验步骤1、准备每人取电泳管1支，标好号码，并在距电泳管下端7cm和7.5cm处画横线做标记，在橡胶帽中滴1滴蔗糖溶液后，套在电泳管底端。试剂分离胶溶液（ml）浓缩胶溶液（ml）分离胶缓冲溶液（pH8.9）1.25—浓缩胶缓冲溶液（pH6.7）—1.25单体交联剂2.51.0DDW6.197.65催化剂（10%AP）0.100.10TEMED0.020.02成胶时间30min15min浓度7.5%(孔小)3%（孔大）2、制胶：取小烧杯2个，按表加液3.灌柱⑴按上述操作，把分离胶溶液混匀，用滴管将分离胶溶液加入到电泳管中，高至7cm处。然后在胶面上沿管壁缓缓注入0.5cm高的水层，切勿打乱凝胶液面，静置30min左右。⑵待分离胶成胶后，用细滤纸条吸干上层水分，灌浓缩胶至7.5cm处，再小心沿管壁加DDW高约0.5cm，静置15min左右。⑶该浓缩胶成胶后，弃去上层水分，拔出橡胶帽。

4、样品液制备：血清:0.1ml40%蔗糖:0.1ml于一0.5mlEP管中混匀备用0.05%溴酚兰:0.1ml

5、装电泳管：先将电泳缓冲液倒入下槽，再将电泳管装到电泳槽内，用电泳缓冲液灌满胶管底部空隙，排净空气，注意对称放置，使其散热均匀。最后将上槽灌满缓冲液，排净电泳管里的气泡。6、上样：用微量加样器吸样品液10ul，加在浓缩胶上正中央。7、电泳：上槽——负极下槽——正极电流：先浓缩胶:1.5mA/管然后分离胶:3.0mA/管

8、剥胶电泳毕，取下电泳玻管，用一长针头注射器(针头长约6～8厘米)，吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水，一边使针头慢慢呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。9、固定和染色：先用固定液固定5分钟，再在培养皿中装染色液，摇床染色10min。10、脱色：加7%冰醋酸摇床脱色，三次，每次2~3min，一周之后观察结果。11、定量：光密度扫描仪定量。实验结果+—观看结果，描出血清电泳区带图谱，确定清蛋白有无异常。

丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。制胶时，要充分摇匀，加速