玉米超氧化物歧化酶的提取及活性测定

玉米超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活性测定一、目的通过对玉米超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质和超滤浓缩的方法和原理。掌握测定超氧化物歧化酶（SOD）的活力和比活力的方法。掌握分级盐析沉淀的方法和原理，以及透析的方法和原理。二、原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,简称SOD）,它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：Cu,Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD。SOD催化如下反应：O：+O2-+2H+S°D》HO+O,22222在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能治疗人类多种病症，如炎症、脑外伤、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老等，对生物体有保护作用。在玉米中，SOD主要存在于胚芽中，当将萌发的玉米籽粒打浆破碎后，以中性盐沉降其蛋白质部分，SOD就存在于沉淀中，但其中有许多杂蛋白，因此在盐析时先用40%（NH4）2SO4去除杂蛋白部分，再用90%（NH4）2SO4饱和上清液，经过一定时间后，再将盐析液离心，取其沉淀进行透析，一定时间后，则其中的SOD成分即被浓缩分离。超滤也是一种蛋白质浓缩方法，其工作原理是运用液压迫使溶质透过膜，并按溶质分子量、形状、大小的差异，把大溶质分子阻留在膜的一侧，而小分子溶质则随溶剂透过膜到另一侧，使大小溶质分子得到分离。利用此原理只要选择适当的超滤膜即可将玉米浆中SOD与其它小分子杂蛋白、可溶性糖等分离，并去除水份，得到SOD浓缩液。SOD活性的测定：采用NBT光还原法。其原理为核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2-，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），既而还原成二甲月替（呈兰色）。该产物在560nm下有最大吸收峰。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2+O2,从而抑制了NBT光还原的进行，使兰色二甲月替生成速度减慢。通过加入不同量的SOD，一定时间后测定560nm光密度的变化，求出抑制NBT光还原的50%的酶液量作为一个酶活力单位。三、主要实验材料、试剂和仪器实验材料：玉米籽粒。试剂：注意配好每一试剂时，应立即转入试剂瓶当中，不要将试剂放在容量瓶当中存放，一定要及时将试剂瓶贴好相应的标签，标明溶液的浓度、pH值、体积、试剂名称、配制时间、配制人。配制时一定要标清，使用时注意不要将其弄掉，这一点将给您带来无比的快捷和方便。在未经老师允许的情况下，不要随意倒掉实验室内的任何药品或试剂。不要随意乱动仪器的开关及旋纽等，否则损坏全额赔偿。（1）1%次氯酸钠：用移液管准确吸取4mL次氯酸钠，置于500mL大烧杯中，再用量筒准确量取400mL自来水稀释该次氯酸钠。（2）提取缓冲液：0・05mol/L磷酸氢二钾一磷酸二氢钾缓冲液，pH7・8。具体配制方法如下：首先是1mol/LpH7.8的磷酸钾缓冲液母液的配制。1mol/LKH2PO4溶液：称取13・6gKH2PO4，置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。1mol/LK2HPO4溶液：称取22.8gK2HPO4，置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，可稍加热，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。取5mLa液与55mLb液混合后，调节pH为7.8，该液即为1mol/L的磷酸钾缓冲液母液。0.05mol/LpH7.8磷酸钾缓冲液的配制(内含1mmol/LEDTA及0.1%。-巯基乙醇)：称取EDTA-2Na-2H2O0.372g置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000mL容量瓶中，用移液管吸取1mLp-M基乙醇置入该1000mL容量瓶中，用50mL量筒量取50mLc液至该1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。测试缓冲液：0.026mol/LMeL磷酸钠缓冲液具体配制方法：首先是0・1mol/LpH7.8Na2HPO4—NaH2PO4缓冲液母液的配制。称取Na2HPO4•12H2O(MW=358.14)35.814g于100mL小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，移入1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。称取NaH2PO4•2H2O(MW=156.01)1.56g于50mL小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。量取915mLa液与85mLb液混合后，该液即为0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液母液。称取L-Met(MW=149.2)0.1941g于50mL小烧杯中，用少量0.1mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液溶解后，移入50mL容量瓶中，用0.1mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液定容至刻度。7.5X10-4mol/L氯化硝基四氮唑蓝(NBT)称取NBT(MW=817.7)0.0613g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度(最好现用现配，也可贮于冰箱中用2~3d)。2X10-smol/L核黄素溶液称取EDTA(MW=292)0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。称取核黄素(MW=376.36)0.0735g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。合并a液和b液，移入100mL容量瓶中，并充分用蒸馏水洗净上述a和b两个小烧杯，将洗液移入该容量瓶中，再用蒸馏水定容至刻度(含EDTA0.1mmoL核黄素2mmol)。贮于冰箱中，避光保存。测定酶活临用前，将c液稀释100倍，即为2X10-5mol/L核黄素溶液。苯甲酸钠：1瓶。BaC以1瓶。(NH4)2SO4：500g/瓶,1瓶/大组。仪器：天平3台，胶体磨1台，超滤器(0・5m2)1台，恒温培养箱1台，高速冷冻离心机1台，可见分光光度计5台，光照箱3台，移液管架5个，移液管(10mL，5mL，2mL，1mL，0.5mL，0.2mL各10支)，微烧杯(10-15mL)130个，量筒(100mL，50mL，1000mL各3个)，容量瓶(100mL，50mL各10个)，烧杯(100mL，250mL各5个)，125mL棕色试剂瓶12个，125mL白色试剂瓶10个，1000mL白色试剂瓶6个，1000mL棕色试剂瓶5个，纱布等。四、操作方法SOD粗提液的制备取200g玉米籽粒用自来水洗净后，用1%次氯酸钠400mL漂洗10min消毒后，然后用自来水彻底洗净，置于器皿中，于28°C恒温培养箱中浸泡吸胀24h后，用自来水洗净，去掉多余的水分，用四层纱布蒙好，置于28C恒温培养箱中发芽24h后，用自来水洗净，再用蒸馏水润洗一次后，进行扒胚，不要求胚的完整性，将胚置于大研钵中，用0.05mol磷酸氢二钾一磷酸二氢钾提取缓冲液50mL，另外加入1g苯甲酸钠，在研钵中充分研磨，再加0.05mol磷酸氢二钾一磷酸二氢钾提取缓冲液50mL，匀浆，在室温下轻轻搅拌4次/h，浸提1h，8500r/min离心20min，弃沉淀，所得上清液用四层纱布过滤以除去漂浮物，即为酶的粗提液。将上述粗酶液称量总体积后，再留取10mL粗酶液，用于测定盐析前的酶活力及比活力和实验九的电泳。SOD浓缩（1）盐析将上述剩余的酶粗提液先以40%（NH4）2SO4饱和1h,8500r/min离心20min去除沉淀，留取上清液，再用90%（NH4）2SO4盐析24h,8500r/min离心40min，弃去上清液，沉淀用0・05mol/LpH7.8磷酸氢二钾一磷酸二氢钾提取缓冲液5mL重溶，以蒸馏水透析过夜。将透析液8500r/mim离心20min后，弃沉淀，留取上清液，并量取其体积，即为酶浓缩液。用于测定透析后的酶活力及比活力与浓缩倍数及回收率，以及用于实验九的电泳。（2）超滤浓缩取酶粗提液经0.5m2超滤器（膜的截留分子量为1万）浓缩后，量取体积，计算酶活力、比活力、浓缩倍数及回收率。SOD活性测定表反应体系中各试剂及酶液的取量杯号（单位均为mL）试剂3(Met)蒸馏水试剂4(NBT)酶液（玉米SOD）试剂5（核黄素）11.50.90.300.321.50.90.300.331.50.90.300.341.50.850.30.050.351.50.800.30.100.361.50.750.30.150.371.50.700.30.200.381.50.650.30.250.3注：酶液为盐析前的和透析后的两个样品，一个为粗酶液，一个为浓缩液。取8个微烧杯，编好号后，以反应系统总体积为3.0mL计算，按上表加入各试剂及酶液。试剂加入后充分混匀，取1号微烧杯放入暗处作为空白（调零时用）。其它7个微烧杯放入4500Lux日光灯照射下启动反应，15min后遮光终止反应。在560nm波长下测定光密度，以2,3号杯的OD值计算出不同酶液量在其反应系统中抑制NBT光还原的相关百分率。然后以所加酶液量为横坐标，以抑制百分率为纵坐标作图，画出两者的相关曲线，找出50%抑制率的酶液量，此酶液量即为一个酶活力单位。五、结果计算g、心5、酶液总体积（mL）X稀释倍数总酶活力（U/g）=抑制50%的酶液量（mL）X样品重（g）一抑制率=—D-D2—X100%D1比活力（U/mg）=酶活力（U）其中：D1为总蛋白mg数2、3号杯的平均OD值；D2为加入不同酶液量的OD值。其中：D1为古浓缩后酶活力（U）…5回收率—e、X100%总酶活力（U）提纯倍数=浓缩嚣活力驾'

浓缩前比活力（U/mg）六、讨论思