体外诊断试剂临床研究讲义

体外诊断试剂的临床研究

第1页，共32页。体外诊断试剂的种类化学或生化检测试剂免疫学检测试剂抗原检测抗体检测核酸检测试剂核酸杂交技术核酸扩增技术其他试剂第2页，共32页。核酸扩增技术目的片段的扩增聚合酶链反应（PCR）以转录为基础的扩增技术（TAS）链取代的扩增技术（SDA）探针的扩增连接扩增反应（LAR）以FEN-1DNA聚合酶为基础的扩增循环探针信号扩增第3页，共32页。免疫检测的原理直接法间接法第4页，共32页。免疫反应中按标记物分类同位素标记的放射免疫法酶标记的酶联免疫法生物素标记化学发光物质标记的化学发光法荧光素标记时间分辨法其他标记物第5页，共32页。临床研究的意义以及目的临床前样品虽有代表性，但数量毕竟有限并不能完全代表临床情况通过临床试验对临床前制定的各项指标进行修正可以发现或预测在实际应用中遇到的问题，在说明书中提醒用户注意第6页，共32页。临床研究的基本要求伦理考虑一般样品特殊样品对研究对象保密临床前研究结果第7页，共32页。对临床研究单位以及人员的要求从事相应的工作具有相应的技术人员有相应的仪器设备如果试剂对仪器无特殊要求，则应选择不同品牌或不同型号有不同专业人员参加至少两家省级单位对实施实验单位的能力进行评价指综合能力包括检测能力、仪器设备和人员等,主要检测盲样，符合要求这方能参与第8页，共32页。对照方法或试剂的要求新诊断试剂疾病症状以及临床诊断相关试剂研究对象的追踪随访疾病的判断标准已有同类产品的试剂可选择同类试剂;若评价试剂所用的原料为基因工程产品，应用非基因工程原料制备的试剂进行评价；对结果不一致样品的处理

第9页，共32页。临床样品的选择人群:根据试剂的适应症选择不同的人群样品:应为自然人群，尚未用同类试剂进行筛查过选择不同地区:代表被测物的不同流行率，代表被测物的不同基因型或血清型疾病的时期:样品的数量:

第10页，共32页。检测方法盲法平行检测结果不一致样品的进一步分析第11页，共32页。诊断试剂的临床评价指标

灵敏度（Sensitivity）：在阳性样品中检出阳性样品的百分比特异性（Specificity）：在阴性样品中检出阴性样品的百分比样品分布(eg.STDEV;)

Suitabilityofcut-off阴性预期值(NPV)：若样品没有反应，则不含检测物的可能性阳性预期值(PPV)：若样品有反应，则含检测物体的可能性重复性（Reproducibility）准确性（Accuracy)

精确性(Precision）第12页，共32页。灵敏度定义：试剂的检测限度方法：检测一定数量的阴性样品，计算均值和标准差均值和标准差，临界值等于均值加上2个标准差意义：在临界值以上的样品有95%为真阳性

临界值的评估：检测一系列正常人群、非正常人群和特殊人群对临界值进行核对表示方法：以量值表示（如ng，单位，CFU/ml，PFU/ml，拷贝数等）；以稀释度表示第13页，共32页。影响灵敏度的因素特殊疾病

有一些特殊的病人，其代谢异常可能影响标志物的检测干扰物质或抑制物质可以来自与病人（药物）；也可来自于样品的处理过程（反复冻融，溶血等）；或样品本身存在抑制物等样品基因型和血清型的影响

有些被测物存在多种基因型或血清型，若原材料没有广谱性，则可影响灵敏度试剂的灰区：

对特殊的试剂要制定灰区，如FDA要求HCV抗体试剂临界值以上均为灰区，对灰区样品要加倍重试第14页，共32页。核酸检测抑制物的作用原理核酸扩增需要酶的参与酶发挥作用需要辅助因子以及特殊的条件辅助因子与酶的特殊部位物理结合后发生反应任何结合辅助因子、改变环境或阻止酶与辅助因子特异结合的物质均抑制反应第15页，共32页。核酸扩增常见的抑制物血红素及其代谢物影响DNA聚合酶的反应，不同来源的DNA聚合酶受影响程度不同痰中的酸性多聚糖或糖蛋白均影响DNA聚合酶的反应脑脊液和尿中可能含有抑制物，但具体物质不明确粪便中的胆汁盐是PCR反应的强抑制剂肝素可与DNA聚合酶结合，对不同的酶抑制程度不同核酸提取试剂中的某些物质具有抑制作用：EDTA，SDS，盐酸胍等第16页，共32页。内标的种类未修饰性的内标异源性内标修饰性的内标第17页，共32页。特异性定义：主要指假阳性的检出情况评价方法：主要是通过检测部分样品，或特殊样品尤其是性质相近的标志物（如不同基因型或血清型样品），分析出现假阳性的情况；而且分析时要注意在不同量时的特异性第18页，共32页。造成非特异性的因素原料：主要纯度不够，原料本身存在非特异反应物质反应模式：如孵育时间缩短非特异反应可提高3-4倍，非常短时可高达10倍样品中的干扰物质：病人本身：如自身免疫性疾病（高免疫球蛋白血症等），黄疸类、溶血类和高脂类病人病人使用特殊药物样品处理过程：如不同抗凝剂，不同试管，某些化学或去污剂以及样品反复冻融等因素第19页，共32页。核酸检测中造成非特异性的因素交叉反应：主要是引物序列与被测物中序列存在一定程度的同源性样品之间的污染：气溶胶中含有目的微生物，对照的污染等扩增产物的污染：扩增产物聚集在器皿、台面、设备以及通风设施上等造成污染第20页，共32页。污染的处理酶的灭活（UNG）主要用于灭活产物光化学处理用可溶性psoralen的衍生物处理，在用长紫外照射即可灭活产物、也可减少样品的污染化学处理方法用于表面的处理

10%次氯酸钠紫外照射物理的:

专用移液器、一次性试管架、紫外灯、PCR工作罩、滤芯吸嘴。第21页，共32页。样品典型的正态分布NegativepopulationPositivepopulationFrequencyofobservations0100110Percentageofmaximumsignal(log)Cut-off第22页，共32页。特异性与值关系的分析企业假阳性特异性（%）值金豪万泰GBI耀华科华丽珠华美新创普生绿科中山理利Murex梅里埃32510327151822114

99.7099.8099.4999.9010099.7099.8099.2998.4899.9099.1997.7798.8899.59-3.985-3.688-3.423-3.364-3.687-2.741-4.337-3.636-2.261-3.060-2.778-1.774-3.551-4.311样品库有985份样品。特异性与其“δ”值相关性系数为0.691,具有显著的统计学意义(P=0.004）

第23页，共32页。

d-d+

值的计算以及意义

delta=d/SDcut-offlog10[OD/CO]XX0FrequencyOD/COdatamustbetransformedtolog10valuesbeforetheanalysis第24页，共32页。数值的计算样品的实际状态

+--+检测结果

--

ABCD

A+BC+D

A+CB+D灵敏度=A/（A+C);特异性=D/（B+D）阳性预期值:1)简单的计算方法即：PPV=A/（A+B）可以给出一个大约的数值;

2)精确的计算方法即：PPV=流行率×敏感性/｛流行率×敏感性+（1-流行率）×（1-特异性)｝阴性预期值:1)．简单的计算方法即：NPV=D/（C+D）可以给出一个大约的数值

2)．精确的计算方法即：NPV=(1-流行率）×特异性/｛（1-流行率）×特异性+流行率×（1-敏感性)｝

第25页，共32页。精确性(Precision)作用：评价试剂的随机误差通过重复检测某一或某些特定样品并分析其一致性，通常以变异系数或相对标准误来表示样品的要求：最好应含有高、中、低三类每一类样品至少检测4次，实际上检测10次或10次以上第26页，共32页。准确性（accuracy)主要评价试剂的系统误差，反映样品的检测值和真实值的一致性表示方法：偏差（%）=（检测值-真实值）X100/真实值评价方法：

1.在某一样品中加上已知量的检测物重复检测，计算检测值与预期值的偏差2.检测已知量的参考品，计算检测量与标化量的偏差第27页，共32页。定量范围定义：能够给出准确量值的范围建立的方法：主要对系列稀释样品的反复检测制定的定量曲线：线性或非线性要求：对定量范围的上限和下限样品进行检测时，其精确性仍能符合要求第28页，共32页。重复性（Reproducibility）不同实验次数之间（Run-run）不同实验室之间（Site-site）不同实验人员之间（Operator-operator）不同时间之间（Day-day）特殊情况下的重复性第29页，共32页。定量试剂的特殊要求样品所含被测物的量应该分散应含有在最高和最低检测限的样品与参比试剂的检测结果计算相关性，而且要统计两种检测结果的量值有无统计学差异第30页，共32页。谢谢第31页，共32页。内容梗概体外诊断试剂的临床研究。酶标记的酶联免疫法。临床前样品虽有代表性，但数量毕竟有限并不能完全代表临床情况。可以发现或预测在实际应用中遇到的问题，在说明书中提醒用户注意。如果试剂对仪器无特殊要求，则应选择不同品牌或不同型号。指综合能力包括检测能力、仪器设备和人员等,主要检测盲样，符合要求这方能参与。人群:根据试剂的适应症选择不同的人群。均值和标准差，临界值等于均值加上2个标准差。临界值的评估：检测一系列正常人群、非正常人群和特殊人群对临界值进行核对。有一些特殊的病人，其代谢异常可能影响标志物的检测。干扰物质或抑制物质。任何结合辅助因子、改变环境或