生物化学与分子生物学进展-pcr技术2016级

中山大学中山医学 神奇而又简单的PCRPCR可以在3小时内把指数放PCRPCR：PolymeraseChain一、最初的理论描述—Khorana(1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA。”但由于当时序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未以及引物合成的，这种想法似乎没有实际意义。加上70年代初分子克隆技术的出现提供了一种克隆和扩增的途径，所以，Khorana的设想们遗1985年，1985年，KaryMullis在Cetus公司工作期间，发明了Mullis要合成DNA引物来进够多的模板DNA序工作，却常为没有1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上二、二、PCR技术的发明—KaryPCR从构想成为现1983年12Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49长度的第一个PCR片段 号4,683,202），Mullis是第一发明人；在Science杂志 了第一篇PCR的学，Mullis是共同作者 有关PCR

PCRPCRPCR标准的PCR标准的PCR 各 各0.1～1.0TaqDNA聚合 0.5～缓冲液（Mg2+）1.5～模板 有关PCR有关PCR1983

有关PCR反

55℃退94℃变55℃退 XX℃延伸（DNA聚合酶 ??PCRPCRTaqDNA聚合酶（Thermus 60 Saiki,1988温Saiki,1988 PCRPCR循19881988年第一台PCR仪问世，PCR逐步实现自动 1993年，Mullis因此项技术荣 化学奖KaryB.KaryB.PCR仪的变三个水浴锅，用手移PCR仪的变电加热块＋自来水冷 电加热块＋内置循环液冷 三个加热块＋机械 半导体制冷和加热（MJPEBioMetra空气梯度PCRPCRLab-on-chip式的PCR仪(普通PCR仪、梯度PCR 全新4通道实时荧光定量PCR无细胞分子克隆法：以拟扩增的NA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在NA聚合酶的作用下，按照半保留 的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的 段得到扩增。另一方面，合成的DN 段也可以作为模板，因而PCR技术可使NA的合成量呈指数型增长。过退火过退火变性变性延伸1st2nd3rd延伸1st2nd3rd 55 72

×30 PCRPCR灵敏度30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝将模板从皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水能从100万个检测的灵敏度可达3个细菌检测的最小检出率为3个细特异性引物序列与模板结合的特异快速简加好反应液，2～4小时即可完PCRPCR1）1）不对称2多重LP-锚定PCR7位逆转录1.1.不对称目的：扩增产生特异长度的单链DNA用途：核酸序列测定的模板组DNA低浓度低浓度引 2PCR2PCRreverse 序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩 文库DNA；建 组步移文库33PCR（复合在同一在同一PC反应体系中，设计多对引物，同时扩增一份DNA样品中几个不同靶区域的DN段，这一过程称为多重PC。可用于检测特定序列的大小、缺失、突变是否存在。123443 电电泳DMDDMD条带,说明外显子8～19B：A中未扩增外显子多重PCR检测DMD缺测目测目 4.LP-PCR（Labelled12341234标记引观 标记引观5.5.锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR的局限：需了解靶片段两侧的序对于未知序列怎么办锚定PC首先合成第一链cDN,然后再添加一同聚物尾（与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点)一起作PC扩增CC…CCCC…CC6.6.PCR可用 的制77原位聚合酶链式反应（Inls－PC）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测 来检测细胞内的扩增产物。适用于检测病理切片中含量较少的靶序原位原位PCR既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（IH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高但却未能与细胞形态学研究相结合。R则可把这两者结合起来,成为细胞学 中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内 、细胞内 重排以及分析细胞内NA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在 方面也具有重要意义。细胞或组织固定细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进PCR扩增细胞内目的片A.阳性对 B.对 C.原位检测mRNA表8.8.逆转录

杂化双ＤＮＡ聚合

99荧光定荧光定•或荧光标记的特异性的探针,对PCR行标 ,实 反应过程,结合相应 可荧光定量PCR•荧光定量PCR 荧光定量荧光定量PCRSYBRGreenSYBRGreenMolecularBeaconsDualAmplifluorSYBR-Green

SYBR-Green

分子信标（MolecularBeacon荧光定量PCR与普通PCR的比实对样品扩增的整个过程进行实 ,能够实时地观察到产物的增加直观地看到反应的对数降低增加全 ,准确的算法进行定结果分析更加快捷方便,普通PCR荧光定量PCRPCRPCR目 扩增和鉴定；DNA序列测定；定点突变 表达分 其 PCR技术应用于科学研分子克隆（目的的获取和鉴定质粒质粒EcoREcoRBamHPCR(5’端引入限制酶识别位BamHEcoREcoRBamBamHPCRPCRK5通过抑制肿瘤血管新生抑制肝癌生长（RT-PCR技术获得）0PBS0PBS0013182124293236grafedPBSgroupK5grouptumor

tumorYangX,etal.CancerBiology&Therapy,tumorGuX,YangX*,etal.Apoptosis.2011LiL,YangX*,etal.JBiolChem.2014.PCR技术应用于科学研围绕二硫键构建不同结构的K5缺失突变体（PCR－缺失突变YangX,etal.JournalofCellularandMolecularMedicine,LiC,YangX,etal.Cornea.PCR技术应用于临床检临内 AAPCR技术应用于临床检 正常AA 病原微生物登登登登3：待测样品 4：已5:待测样品6:待测样品37:阳性模前C区1896位点突变检前C区1896位点突变检测试剂分型检测试剂在学分学分药物治疗方案的确随药物（疗效评价恩替卡韦耐药检测试剂阿德福韦耐药检测试剂拉米夫定耐药检测试剂 试剂PCR-RFLP法：(PCR产物限制性酶切片断多态性分RasRas限制性内切突突限限制性内切正 正突电泳电泳PCR技术应用于法医学鉴法医学物证鉴方法：PCR-RFLP（限制片段长度多态性PCR-ASO