例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽课件

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽2022/11/26例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽2022/11/26例子1有关谷胱甘肽的基本知识

生物活性三肽化合物小分子硫醇类化合物含有-肽键主要有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形态例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽有关谷胱甘肽的基本知识生物活性三肽化合物例子1产朊假2谷胱甘肽的形态转换

图1-1酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化过程

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的形态转换图1-1酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化3谷胱甘肽在自然界中的分布情况动物：肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体植物：蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类微生物：酵母（主要为Saccharomyces属和Candida属）

谷胱甘肽主要以GSH形式存在，大多数生物细胞中GSH与GSSG的比例约为100:1。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽在自然界中的分布情况动物：肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状4谷胱甘肽的功能

维持生物体内适宜的氧化还原环境

广泛用于生物化学、医学、生物学和化学的研究测定

GSH可以迅速增强机体的免疫力

对消化系统、呼吸系统和新陈代谢等都有很大帮助

GSH具有消除疲劳的作用近年来还发现GSH具有抑制艾滋病病毒的功效

加拿大麦基尔大学教授古特曼博士这样预测：“GSH很快就会象胆固醇一样深入民心，成为人们衡量健康的指标之一”。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的功能维持生物体内适宜的氧化还原环境例子1产5

GSH多用于治疗肝脏疾病解毒抗辐射抗肿瘤、癌症抗氧化衰老协调内分泌疗效明显且无副作用，这些同类药物所不具有的优点使得GSH在临床医药领域有着极为广泛的用途。谷胱甘肽应用于临床例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽GSH多用于治疗肝脏疾病谷胱甘肽应用于临床例子1产朊假6表1-1GSH的生理功能及其在临床上的应用例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表1-1GSH的生理功能及其在临床上的应用例子1产朊假7谷胱甘肽应用于食品行业GSH具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子GSH在强化食品风味的同时对人体有保健作用它在食品行业的应用前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧化剂表1-2GSH在食品加工业中的用途

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽应用于食品行业GSH具有独特的生理功能，被称为8谷胱甘肽的应用前景医药工业食品工业体育运动生物研究GSH有一个巨大的市场研究兴趣日益增长需求量不断增加昂贵的市场价格GSH在各领域中的广泛应用限制例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的应用前景医药工业GSH有一个研究兴趣日益增长需求量9谷胱甘肽的制备方法

有机溶剂萃取法化学合成法生物技术法

酶转化法

发酵法例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的制备方法有机溶剂萃取法例子1产朊假丝酵母发酵法10酶法合成谷胱甘肽

谷胱甘肽合成酶系酶活的提高

ATP再生系统的构建

E.coli细胞中的乙酸激酶反应S.cerevisiae细胞中的糖酵解途径

固定化酶（细胞）技术的应用

提高ATP的转移效率以及增加ATP在反应体系中的稳定性，以实现ATP再生系统的高效运行。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽酶法合成谷胱甘肽谷胱甘肽合成酶系酶活的提高例子1产朊假11发酵法生产谷胱甘肽

高产菌株的选育发酵过程的优化及控制

基因工程菌在谷胱甘肽生产中的应用例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵法生产谷胱甘肽高产菌株的选育例子1产朊假丝酵母发酵12高产菌株的选育

图1-3高产GSH酵母菌株的选育方法与结果

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽高产菌株的选育图1-3高产GSH酵母菌株的选育方法与结13发酵条件优化

营养成分的选择培养条件的优化发酵过程控制

控制葡萄糖的浓度：流加发酵控制细胞比生长速率：提高比GSH合成速率前体物质的添加添加策略：一次性添加、连续添加等发酵过程的优化及控制例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵条件优化发酵过程的优化及控制例子1产朊假丝酵母发酵14基因工程技术的应用

提高GSH合成酶系的酶活：增加质粒的拷贝数降低酶系对GSH的敏感性：构建脱敏菌株

！需要考虑质粒的稳定性！例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基因工程技术的应用提高GSH合成酶系的酶活：增加质粒的15发酵法生产谷胱甘肽研究中仍存在的问题

对C.utilis发酵生产GSH的细胞生长规律和GSH合成特性还缺乏了解还没有发现从发酵动力学的角度，来分析并获得GSH发酵过程中出现的规律性结果

在流加发酵中，高细胞密度和高GSH合成能力的矛盾还没有解决未见运用代谢理论及其手段为GSH合成过程中发生的变化寻求合理的解释如何将胞内GSH分泌至胞外也需要深入研究例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵法生产谷胱甘肽研究中仍存在的问题对C.util16发酵法生产谷胱甘肽研究的意义

日本协和发酵和味之素公司在上世纪80年代就已实现GSH的工业化生产，并基本垄断国际市场我国在该方面的研究相对滞后日本以明显的差价将GSH销往欧美和我国（欧美250美元/kg，我国450美元/kg）因此，大力研制开发并获得具有自主知识产权的GSH生产技术，对于我国功能食品和医药工业的发展都具有重要的意义。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵法生产谷胱甘肽研究的意义日本协和发酵和味之素公司17发酵过程优化原理外因：基于微生物反应原理的培养环境优化技术内因：基于代谢特性的分阶段培养技术外因定量化：基于动力学模型分析的优化和控制技术内因定量化：基于代谢通量分析的过程优化技术例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵过程优化原理外因：基于微生物反应原理的培养环境优化技术例18微生物细胞基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）创造一个适于微生物生长和代谢的环境关键技术1在一个生物反应体系中例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽微生物细胞基于微生物反应原理的培养环境优化技术创造一个适于微19基于代谢特性的分阶段培养技术(内因）基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）创造一个适于微生物生长和代谢的环境关键技术2在一个生物反应体系中控制细胞代谢特性，与优化的环境相适应例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基于代谢特性基于微生物反应原理的培养环境优化技术创造一个适于20基于代谢特性的分阶段培养技术(内因）基于动力学模型分析的优化和控制技术(外因，定量化）关键技术3在一个生物反应体系中控制细胞代谢特性，与优化的环境相适应基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基于代谢特性基于动力学模型分析的优化和控制技术关键技术3在21基于代谢特性的分阶段培养技术(内因）基于动力学模型分析的优化和控制技术(外因，定量化）关键技术4在一个生物反应体系中基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）基于代谢通量分析的过程优化技术(内因，定量化）例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基于代谢特性基于动力学模型分析的优化和控制技术关键技术4在22本研究的主要内容

课题来源：江苏省高校高新技术产业发展项目“微生物发酵法生产谷胱甘肽”研究目标：酵母细胞和GSH的高产量、高得率和高生产强度研究内容：（6个部分）产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本研究的主要内容课题来源：江苏省高校高新技术产业发展项目“23产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件

谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件例子1产朊24碳源种类对谷胱甘肽发酵的影响

表2-1各种碳源对细胞生长及GSH合成的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽碳源种类对谷胱甘肽发酵的影响表2-1各种碳源对细胞生长25图2-2糖类碳源对细胞生长及GSH合成的影响

■Glucose;○Sucrose;◆Fructose例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图2-2糖类碳源对细胞生长及GSH合成的影响例子1产朊26氮源种类对谷胱甘肽发酵的影响

图2-3各种氮源对细胞生长及GSH合成的影响

□Beefextract;●Peptone;▲Yeastextract;■Urea;○(NH4)2SO4;◆NH4Cl;

NaNO3

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽氮源种类对谷胱甘肽发酵的影响图2-3各种氮源对细胞生长27混合氮源对谷胱甘肽发酵的影响

图2-4混合氮源（硫酸铵+尿素）对细胞生长及GSH合成的影响

Mixednitrogensourceconcentration:■6g·L-1;○8g·L-1;▲10g·L-1

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽混合氮源对谷胱甘肽发酵的影响图2-4混合氮源（硫酸铵+28KH2PO4和MgSO4对谷胱甘肽发酵的影响

图2-5不同浓度磷酸二氢钾和硫酸镁对GSH生物合成的影响■GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽KH2PO4和MgSO4对谷胱甘肽发酵的影响图2-5不29谷胱甘肽发酵的营养条件正交优化试验

表2-2L16(45)正交试验因素水平表

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽发酵的营养条件正交优化试验表2-2L16(430表2-3正交试验数据及BP神经网络处理结果例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表2-3正交试验数据及BP神经网络处理结果例子1产朊假31图2-6正交试验结果直观分析

■GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent

以提高GSH产量为目的（即Y2最大化），通过直观分析图获得的较优化的营养条件组合为A2B3C2D4E2，即葡萄糖浓度30g·L-1，(NH4)2SO4浓度4g·L-1，尿素浓度4g·L-1，KH2PO4浓度3g·L-1，MgSO4浓度0.25g·L-1。这与BP神经网络预测的结果是一致的。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图2-6正交试验结果直观分析以提高GS32环境条件对谷胱甘肽发酵的影响

图2-7环境条件对C.utilisWSH02-08细胞生长及GSH合成的影响■GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽环境条件对谷胱甘肽发酵的影响图2-7环境条件对C.u33

C.utilisWSH02-08生产谷胱甘肽的摇瓶发酵过程

图2-8C.utilisWSH02-08摇瓶发酵生产GSH过程曲线●Residualglucose;

pH;■GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽C.utilisWSH02-08生产谷胱甘肽的摇瓶34摇瓶分批补糖方式对谷胱甘肽发酵的影响

表2-4摇瓶中不同补糖方式对GSH发酵的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽摇瓶分批补糖方式对谷胱甘肽发酵的影响表2-4摇瓶中不同35本章小结：1、确定了C.utilisWSH02-08发酵生产GSH培养基的营养成分及其浓度组合；2、以实现细胞的高产和GSH的高合成为目标，获得了较优的环境条件组合；3、摇瓶发酵结果表明，DCW最大值达9.0g·L-1，GSH最大浓度208.3mg·L-1，胞内GSH含量2.35%；4、总糖浓度固定的情况下，适当的补糖策略对GSH的合成有一定的促进作用。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽36产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件

谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学

流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件例子37溶氧对谷胱甘肽分批发酵的影响图3-1不同搅拌转速下发酵过程的溶氧变化趋势1—350r·min-1;2—300r·min-1;3—250r·min-1;4—200r·min-1

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽溶氧对谷胱甘肽分批发酵的影响图3-1不同搅拌转速下发酵38图3-2不同搅拌转速下的GSH分批发酵过程◆200r·min-1;■250r·min-1;

△300r·min-1;

○350r·min-1

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-2不同搅拌转速下的GSH分批发酵过程例子1产朊假丝39不控制pH的谷胱甘肽发酵过程图3-3不同pH控制方式下GSH发酵过程曲线□glucose;■DCW;▲extracellularGSH;△intracellularGSH;○pH;◆totalGSH;●intracellularGSHcontent;PanelA-C,nopHcontrol;PanelD-F,pH5.5发现低pH培养环境下，产朊假丝酵母胞内合成的GSH大量向胞外渗漏例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽不控制pH的谷胱甘肽发酵过程图3-3不同pH控制方式下40控制恒定pH时的谷胱甘肽发酵过程图3-4不同恒定pH条件下GSH发酵各过程参数比较

□DCW;■

PGSH;

μ;◆

qP;△GSHcontent;▲GSHconcentration;○

YX/S;●

YP/S

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽控制恒定pH时的谷胱甘肽发酵过程图3-4不同恒定pH条41基于动力学模型解析pH对谷胱甘肽发酵的影响表3-2不同pH下GSH分批发酵动力学参数模拟结果

KI表示底物浓度对细胞生长的抑制程度，且KI值越高则抑制效应越低。

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基于动力学模型解析pH对谷胱甘肽发酵的影响表3-2不同42图3-5不同pH条件下GSH合成能力及细胞生长比较

pH为5.5时GSH总量达到最大，从动力学角度分析，是因为在这一pH下兼具了KI值高（底物对细胞生长的抑制效应小）、α值低和β值高（细胞生长过程中和生长结束后均可保持较高的比GSH合成速率）的特点。α为直线斜率，表示在μ相同的条件下，细胞合成GSH能力的强弱；β为截距，反映生长停止后（μ=0）细胞继续合成GSH能力的高低。

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-5不同pH条件下GSH合成能力及细胞生长比较α为43不同温度下的谷胱甘肽发酵过程分析图3-6不同温度条件下GSH发酵过程及动力学参数随时间变化情况●andcurve1,32ºC;□andcurve2,30ºC;▲andcurve3,28ºC;○andcurve4,26ºC;△andcurve5,24ºC例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽不同温度下的谷胱甘肽发酵过程分析图3-6不同温度条件下例44表3-3不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表3-3不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较例子145细胞生长动力学模型及其参数估计表3-4不同温度下细胞生长动力学参数模拟结果

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽细胞生长动力学模型及其参数估计表3-4不同温度下细胞生46谷胱甘肽合成动力学模型及其参数估计表3-5不同温度下GSH合成动力学参数模拟结果

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽合成动力学模型及其参数估计表3-5不同温度下G47图3-7温度对C.utilisWSH02-08细胞生长动力学参数的影响及其模拟

不同温度和葡萄糖浓度下的细胞浓度随时间变化情况：例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-7温度对C.utilisWSH02-08细胞48图3-8C.utilisWSH02-08细胞生长动力学模型的验证A:Temperature29ºC,initialglucoseconcentration28.3g·L-1B:Temperature30ºC,initialglucoseconcentration33.2g·L-1

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-8C.utilisWSH02-08细胞生长动49分阶段温度控制策略的提出与实现表3-8不同温度下分批发酵8h前后的平均比生长速率和平均比GSH合成速率比较结果

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽分阶段温度控制策略的提出与实现表3-8不同温度下分批发50图3-9分阶段温度控制策略下的GSH发酵过程曲线◆Glucose;○GSH;▲DCW例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-9分阶段温度控制策略下的GSH发酵过程曲线例子1产51表3-3不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表3-3不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较例子152本章小结：1、在满足细胞生长的范围内，溶氧对胞内GSH含量影响不大。在葡萄糖浓度为30g·L-1且通气量1.2vvm的情况下，将搅拌转速恒定在300r·min-1即可满足细胞生长和GSH合成对溶解氧的需求；2、不控制pH时，发酵液pH迅速下降，至pH1.5时胞内合成的GSH开始向胞外渗漏，最终DCW和GSH产量比pH5.5时的发酵结果分别低27%和95%，且GSH的胞外渗漏量约占GSH合成总量的50%；3、在pH4.0~6.5范围内，pH5.5时最有利于GSH的合成。从分批发酵动力学角度进行分析，解释了pH对细胞生长和GSH合成的影响这一生理学现象；例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽534、在24ºC~32ºC范围内，较高温度对C.utilisWSH02-08细胞生长有促进作用，而较低温度更有利于GSH的合成；5、根据细胞生长动力学参数，得到24ºC~32ºC范围内GSH分批发酵过程中细胞浓度同温度以及底物浓度之间的一般关系式：验证实验结果表明，该模型在24ºC~32ºC范围内可用于预测不同温度下的细胞生长情况；6、提出分阶段温度控制策略：发酵起始温度30ºC，8h后切换至26ºC并保持到发酵结束。结果表明，分阶段温度控制策略的实施可以进一步提高GSH的合成能力，其中GSH产量分别比在26ºC和30ºC时提高了5%和23%，而胞内GSH含量更是高达2.61%。因此，该策略具有很好的实用性。

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽54产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽

前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件例子55初糖浓度对谷胱甘肽分批发酵的影响图4-1不同初糖浓度下的GSH发酵过程○17.2g·L-1;■25.2g·L-1;△33.2g·L-1;●41.8g·L-1;□49.9g·L-1

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽初糖浓度对谷胱甘肽分批发酵的影响图4-1不同初糖浓度下56表4-1不同初糖浓度下的GSH发酵过程参数比较

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表4-1不同初糖浓度下的GSH发酵过程参数比较例子1产57分批补料培养生产谷胱甘肽的发酵过程图4-2分批补料培养方式下的GSH发酵过程■Glucose;○DCW;●GSH;△GSHcontent例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽分批补料培养生产谷胱甘肽的发酵过程图4-2分批补料培养58恒速流加发酵对谷胱甘肽生产的影响图4-3葡萄糖恒速流加下的GSH发酵过程■Glucose;○DCW;●GSH;△GSHcontent;A-B,4.2g·L-1·h-1;C-D,5.0g·L-1·h-1;E-F,6.4g·L-1·h-1

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽恒速流加发酵对谷胱甘肽生产的影响图4-3葡萄糖恒速流加59指数流加发酵对谷胱甘肽生产的影响图4-4葡萄糖指数流加培养下的GSH发酵过程■Glucose;○DCW;●GSH;△GSHcontent例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽指数流加发酵对谷胱甘肽生产的影响图4-4葡萄糖指数流加60不同培养方式下谷胱甘肽生产情况比较表4-2不同培养方式下细胞生长和GSH合成过程参数比较

aFed-batch(1),(2),(3)wererepresentativeforglucosefeedingatconstantrateof4.2g·L-1·h-1,5.0g·L-1·h-1and6.4g·L-1·h-1,respectively,whileFed-batch(4)wasrepresentativeforthecultivationmodeofglucosefeedingataexponentialrate.b

qPreferstospecificGSHproductionrate.例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽不同培养方式下谷胱甘肽生产情况比较表4-2不同培养方式61本章小结：1、不同葡萄糖浓度下的实验结果表明，仅通过分批培养难以实现细胞和GSH高产量、高得率和高生产强度的有机统一；2、分批补料、恒速流加和指数流加等几种培养方式都可以实现酵母细胞和GSH的高产量，其中指数流加还可以同时提高细胞和GSH的生产强度。经过48h的指数流加培养，DCW达到40.9g·L-1，GSH产量和胞内GSH含量均达到最大值857.2mg·L-1和2.25%。

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽62产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件

谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用

谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件例子63L-谷氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响图5-1L-谷氨酸的添加对GSH发酵的影响●0h;□6h;■12h;○16h例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽L-谷氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响图5-1L-谷氨酸的64甘氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响图5-2甘氨酸的添加对GSH发酵的影响●0h;□6h;■12h;○16h例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽甘氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响图5-2甘氨酸的添加对G65L-半胱氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响图5-3L-半胱氨酸对GSH摇瓶发酵的影响○0h;■4h;▲8h;□12h;●16h例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽L-半胱氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响图5-3L-半胱氨66分批发酵中L-半胱氨酸对谷胱甘肽过量合成的作用图5-4L-半胱氨酸对分批发酵过量合成GSH的影响●Glucose;○DCW;■GSH;□Residualthiols;▲Totalthiol;△GSHcontent;A-B,添加8mmo/L的L－Cys;C-D,添加16mmo/L的L－Cys

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽分批发酵中L-半胱氨酸对谷胱甘肽过量合成的作用图5-467流加发酵中添加L-半胱氨酸促进谷胱甘肽的合成图5-5L-半胱氨酸对流加发酵培养生产GSH的影响●Glucose;○DCW;■GSH;□Residualthiols;▲Totalthiol;△GSHcontent例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽流加发酵中添加L-半胱氨酸促进谷胱甘肽的合成图5-5L68L-半胱氨酸对不同培养方式下GSH生产影响的比较表5-1L-半胱氨酸添加对不同培养方式下GSH合成的影响

aAverageqPherereferstotheaveragespecificGSHproductionrateafterL-cysteineaddition.bAverageqPherewasrepresentativefortheaveragespecificGSHproductionrateofthewholeprocess.例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽L-半胱氨酸对不同培养方式下GSH生产影响的比较表5-169本章小结：1、L-谷氨酸和甘氨酸在细胞不同生长阶段的添加对GSH发酵过程并无太大的影响，L-半胱氨酸虽然对细胞生长有抑制作用，但可以大幅度提高GSH产量和胞内GSH含量；2、对于分批发酵来说，在L-半胱氨酸添加前后，GSH的合成量约各占总量的50%，对于流加发酵，最终GSH产量可以高达1150mg·L-1；3、总体上来看，L-半胱氨酸对GSH发酵的影响主要表现在GSH产量和胞内GSH含量提高的幅度上，以及添加前后GSH平均比合成速率变化的差异上。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽70产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件

谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析

表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件例子71代谢工程的概念起源于上世纪90年代初，实质是对细胞代谢通量及其控制进行定量分析，并对代谢进行合理改造，以最大限度提高目的代谢产物的产率涉及生理学、分子生物学、生物化学及生物途径工程学等多门学科常用的定量方法有代谢控制分析、代谢通量分析、生化系统理论、途径分析、控制论模型等代谢通量分析模型（MFA）是代谢工程基础研究中最主要的计算代谢途径中各物质通量的手段MFA假定细胞内的物质、能量处于拟稳态，在测定胞外代谢物浓度和菌体组成的基础上，根据物料平衡和已知的代谢途径计算细胞内的代谢通量代谢工程的基本知识例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽代谢工程的概念起源于上世纪90年代初，实质是对细胞代谢通72图6-1C.utilisWSH02-08分批培养合成GSH的代谢网络结构模型

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图6-1C.utilisWSH02-08分批培养合73代谢通量的计算

代谢通量分析（MFA）最主要的基础是拟稳态假设

采用化学计量方程对各代谢物的质量平衡进行计算

A·r=X

计算原则1、矩阵A中元素的确定遵循“反应为负，生成为正”和“1C-mol基准”原则；2、代谢物通量都是以消耗葡萄糖的比速率为基准的相对碳摩尔通量，葡萄糖的摄入（r1）以100计。

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽代谢通量的计算代谢通量分析（MFA）最主要的基础是拟稳态74图6-2GSH分批发酵第一阶段的代谢通量分布（0~6h）

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图6-2GSH分批发酵第一阶段的代谢通量分布（0~6h75图6-2GSH分批发酵第二阶段的代谢通量分布（6~14h）

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图6-2GSH分批发酵第二阶段的代谢通量分布（6~14765.6图6-2GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布（14~30h）

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽5.6图6-2GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布（14775.3图6-3分阶段温度控制策略下GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽5.3图6-3分阶段温度控制策略下GSH分批发酵第三阶段785.0图6-4L-半胱氨酸添加后GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽5.0图6-4L-半胱氨酸添加后GSH分批发酵第三阶段的79本章小结：1、分析了C.utilisWSH02-08细胞生物合成GSH的代谢网络，发现在分批发酵前期，HMP途径代谢活跃，为细胞的生物合成提供足够的NADPH；在发酵中后期，EMP途径和TCA循环代谢加强，产生更多的NADH和FADH2进入呼吸链被氧化而产生ATP以供给细胞代谢维持的需要；2、温度的切换（30ºC→26ºC）使更多的NADPH参与到CYS的合成成为可能，而经过SER进入CYS碳通量的增加，直接的结果是流向GC和GSH碳通量的增加，因而提高了GSH的产量；3、L-半胱氨酸的添加使HMP途径近似于关闭，碳通量直接进入EMP途径和TCA循环，同时外加的L-半胱氨酸使经过CYS的碳通量大增，最终GSH产量提高将近1倍。

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽80产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件

谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件例子81表面活性剂对细胞生长的影响图7-1不同类型表面活性剂对细胞生长的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表面活性剂对细胞生长的影响图7-1不同类型表面活性剂对82低浓度离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响图7-2低浓度离子型表面活性剂对GSH合成的影响●IntracellularGSH;○ExtracellularGSH；■TotalGSH；□GSHcontent例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽低浓度离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响图7-2低浓83高浓度离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响图7-3高浓度离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响●ExtracellularGSH;○IntracellularGSH;▲DCW;△GSHcontent;■TotalGSH;□TGSH/DCW8h;┄┄16h;──24h例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽高浓度离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响图7-3高84非离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响图7-4非离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响■,□IntracellularGSH;▲,△ExtracellularGSH;●,○TotalGSH;

◆,

TGSH/DCW;┄┄0h;──16h例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽非离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响图7-4非离子型85本章小结：1、离子型表面活性剂SDS和CTAB对酵母细胞生长存在临界浓度现象，醚类非离子表面活性剂Brij30只有在高浓度时才对细胞生长产生部分抑制，而酯类非离子表面活性剂Tween80对细胞生长几乎没有负面影响；2、低于临界浓度的离子型表面活性剂影响了酵母细胞的GSH合成能力，但不能促进GSH向胞外积累；高于临界浓度时，对于培养后期的酵母细胞内GSH的胞外分泌具有积极的作用；3、Brij30在一定浓度下对细胞生长和GSH合成表现出与离子型表面活性剂相似的特点，但对GSH的胞外积累贡献不大；Tween80对GSH发酵过程以及酵母细胞合成GSH的能力几乎没有影响。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽86结论(1)以C.utilisWSH02-08作为微生物发酵法生产GSH的出发菌株。在单因素实验的基础上，采用L16(45)正交表安排发酵培养基中各营养组分及其浓度的正交优化试验，结合BP神经网络的预测，得到以提高GSH产量为目标的营养条件组合为：葡萄糖30g·L-1，(NH4)2SO44g·L-1，尿素4g·L-1，KH2PO43g·L-1，MgSO40.25g·L-1。进一步获得了GSH摇瓶发酵较优的环境条件组合为：初始pH6.0、装液量50mL/500mL、接种量10%。(2)在C.utilisWSH02-08发酵生产GSH的摇瓶培养过程中，26h时DCW达最大值9.0g·L-1，28h时GSH积累至最大浓度208.3mg·L-1，胞内GSH含量2.35%。在总糖浓度固定的情况下，合适的摇瓶补糖方式对GSH合成具有促进作用，最多可以提高GSH产量约10%，胞内GSH含量也高达2.52%。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽结论(1)以C.utilisWSH02-087(3)

在7L搅拌式发酵罐中进行C.utilisWSH02-08分批培养生产GSH，搅拌转速对胞内GSH含量影响较小。因此，当葡萄糖浓度为30g·L-1且通气量控制在1.2vvm时，搅拌转速只要不低于300r·min-1即可满足细胞生长和GSH合成对溶解氧的需求。(4)不同pH控制方式对GSH分批发酵的影响有较大差异。不控制pH时，不仅会引起发酵后期GSH向胞外渗漏，而且最终DCW和GSH产量均比恒定pH条件下的结果低。通过对pH4.0~6.5范围内的各GSH分批发酵过程参数进行比较，发现在pH5.5最有利于GSH的合成，并从发酵动力学的角度解释了pH对细胞生长和GSH合成的影响这一生理学现象。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽(3)在7L搅拌式发酵罐中进行C.utilisWSH88(5)

根据温度同细胞生长动力学参数之间的内在联系，得到GSH分批发酵过程中细胞浓度的变化同温度以及底物浓度之间的一般关系式：

验证实验结果表明，该模型在24ºC~32ºC范围内具有很好的适用性。(6)提出了分阶段温度控制策略：发酵起始温度30ºC，8h后切换至26ºC并保持到发酵结束。该温度控制策略的实施可以进一步提高GSH的合成能力，其中GSH产量分别比在26ºC和30ºC时提高了5%和23%，而胞内GSH含量更是高达2.61%。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽(5)根据温度同细胞生长动力学参数之间的内在联系，得到G89(7)

不同葡萄糖浓度下的实验结果表明仅通过分批培养难以实现细胞和GSH高产量、高得率和高生产强度的有机统一。分批补料、恒速流加和指数流加发酵和分批培养相比均可提高菌体细胞和GSH的产量和生产强度，其中指数流加方式下C.utilisWSH02-08的细胞干重40.9g·L-1，GSH产量857.2mg·L-1，胞内GSH含量2.25%，比较适合于GSH的高效生产。(8)L-半胱氨酸对GSH发酵过程有很大影响，是GSH合成的关键氨基酸。当L-半胱氨酸添加浓度为8mmol·L-1时，摇瓶下GSH产量和胞内GSH含量分别比对照提高了91%和106%；分批培养下GSH产量明显提高，胞内GSH含量高出将近一倍；而对于流加发酵，最终GSH产量可以高达1150mg·L-1，L-半胱氨酸添加后的平均比GSH合成速率更是高出110%。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽(7)不同葡萄糖浓度下的实验结果表明仅通过分批培养难以实现90(9)根据C.utilisWSH02-08利用葡萄糖作为唯一碳源时生物合成GSH的代谢网络，利用代谢通量分析方法分析了典型的GSH分批发酵不同阶段下各代谢物通量的变化规律，对分阶段温度控制策略下和L-半胱氨酸添加时的代谢网络中通量的改变进行比较，并对这些培养方式下GSH的过量合成进行了解释。(10)离子型表面活性剂SDS和CTAB对酵母细胞生长存在临界浓度现象，醚类非离子表面活性剂Brij30对细胞生长只有部分抑制，而酯类非离子表面活性剂Tween80对细胞生长几乎没有负面影响。SDS和CTAB对细胞的GSH合成能力会产生影响，且高浓度的SDS和CTAB在发酵后期加入可以使胞内合成的GSH积累至胞外；Brij30只能部分促进GSH的胞外积累，而Tween80的存在对GSH的胞外积累没有任何作用。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽(9)根据C.utilisWSH02-08利用葡萄91演讲完毕，谢谢听讲!再见，seeyouagain2022/11/26例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽演讲完毕，谢谢听讲!再见，seeyouagain202292例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽2022/11/26例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽2022/11/26例子93有关谷胱甘肽的基本知识

生物活性三肽化合物小分子硫醇类化合物含有-肽键主要有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形态例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽有关谷胱甘肽的基本知识生物活性三肽化合物例子1产朊假94谷胱甘肽的形态转换

图1-1酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化过程

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的形态转换图1-1酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化95谷胱甘肽在自然界中的分布情况动物：肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体植物：蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类微生物：酵母（主要为Saccharomyces属和Candida属）

谷胱甘肽主要以GSH形式存在，大多数生物细胞中GSH与GSSG的比例约为100:1。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽在自然界中的分布情况动物：肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状96谷胱甘肽的功能

维持生物体内适宜的氧化还原环境

广泛用于生物化学、医学、生物学和化学的研究测定

GSH可以迅速增强机体的免疫力

对消化系统、呼吸系统和新陈代谢等都有很大帮助

GSH具有消除疲劳的作用近年来还发现GSH具有抑制艾滋病病毒的功效

加拿大麦基尔大学教授古特曼博士这样预测：“GSH很快就会象胆固醇一样深入民心，成为人们衡量健康的指标之一”。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的功能维持生物体内适宜的氧化还原环境例子1产97

GSH多用于治疗肝脏疾病解毒抗辐射抗肿瘤、癌症抗氧化衰老协调内分泌疗效明显且无副作用，这些同类药物所不具有的优点使得GSH在临床医药领域有着极为广泛的用途。谷胱甘肽应用于临床例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽GSH多用于治疗肝脏疾病谷胱甘肽应用于临床例子1产朊假98表1-1GSH的生理功能及其在临床上的应用例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表1-1GSH的生理功能及其在临床上的应用例子1产朊假99谷胱甘肽应用于食品行业GSH具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子GSH在强化食品风味的同时对人体有保健作用它在食品行业的应用前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧化剂表1-2GSH在食品加工业中的用途

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽应用于食品行业GSH具有独特的生理功能，被称为100谷胱甘肽的应用前景医药工业食品工业体育运动生物研究GSH有一个巨大的市场研究兴趣日益增长需求量不断增加昂贵的市场价格GSH在各领域中的广泛应用限制例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的应用前景医药工业GSH有一个研究兴趣日益增长需求量101谷胱甘肽的制备方法

有机溶剂萃取法化学合成法生物技术法

酶转化法

发酵法例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的制备方法有机溶剂萃取法例子1产朊假丝酵母发酵法102酶法合成谷胱甘肽

谷胱甘肽合成酶系酶活的提高

ATP再生系统的构建

E.coli细胞中的乙酸激酶反应S.cerevisiae细胞中的糖酵解途径

固定化酶（细胞）技术的应用

提高ATP的转移效率以及增加ATP在反应体系中的稳定性，以实现ATP再生系统的高效运行。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽酶法合成谷胱甘肽谷胱甘肽合成酶系酶活的提高例子1产朊假103发酵法生产谷胱甘肽

高产菌株的选育发酵过程的优化及控制

基因工程菌在谷胱甘肽生产中的应用例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵法生产谷胱甘肽高产菌株的选育例子1产朊假丝酵母发酵104高产菌株的选育

图1-3高产GSH酵母菌株的选育方法与结果

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽高产菌株的选育图1-3高产GSH酵母菌株的选育方法与结105发酵条件优化

营养成分的选择培养条件的优化发酵过程控制

控制葡萄糖的浓度：流加发酵控制细胞比生长速率：提高比GSH合成速率前体物质的添加添加策略：一次性添加、连续添加等发酵过程的优化及控制例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵条件优化发酵过程的优化及控制例子1产朊假丝酵母发酵106基因工程技术的应用

提高GSH合成酶系的酶活：增加质粒的拷贝数降低酶系对GSH的敏感性：构建脱敏菌株

！需要考虑质粒的稳定性！例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基因工程技术的应用提高GSH合成酶系的酶活：增加质粒的107发酵法生产谷胱甘肽研究中仍存在的问题

对C.utilis发酵生产GSH的细胞生长规律和GSH合成特性还缺乏了解还没有发现从发酵动力学的角度，来分析并获得GSH发酵过程中出现的规律性结果

在流加发酵中，高细胞密度和高GSH合成能力的矛盾还没有解决未见运用代谢理论及其手段为GSH合成过程中发生的变化寻求合理的解释如何将胞内GSH分泌至胞外也需要深入研究例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵法生产谷胱甘肽研究中仍存在的问题对C.util108发酵法生产谷胱甘肽研究的意义

日本协和发酵和味之素公司在上世纪80年代就已实现GSH的工业化生产，并基本垄断国际市场我国在该方面的研究相对滞后日本以明显的差价将GSH销往欧美和我国（欧美250美元/kg，我国450美元/kg）因此，大力研制开发并获得具有自主知识产权的GSH生产技术，对于我国功能食品和医药工业的发展都具有重要的意义。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵法生产谷胱甘肽研究的意义日本协和发酵和味之素公司109发酵过程优化原理外因：基于微生物反应原理的培养环境优化技术内因：基于代谢特性的分阶段培养技术外因定量化：基于动力学模型分析的优化和控制技术内因定量化：基于代谢通量分析的过程优化技术例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵过程优化原理外因：基于微生物反应原理的培养环境优化技术例110微生物细胞基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）创造一个适于微生物生长和代谢的环境关键技术1在一个生物反应体系中例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽微生物细胞基于微生物反应原理的培养环境优化技术创造一个适于微111基于代谢特性的分阶段培养技术(内因）基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）创造一个适于微生物生长和代谢的环境关键技术2在一个生物反应体系中控制细胞代谢特性，与优化的环境相适应例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基于代谢特性基于微生物反应原理的培养环境优化技术创造一个适于112基于代谢特性的分阶段培养技术(内因）基于动力学模型分析的优化和控制技术(外因，定量化）关键技术3在一个生物反应体系中控制细胞代谢特性，与优化的环境相适应基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基于代谢特性基于动力学模型分析的优化和控制技术关键技术3在113基于代谢特性的分阶段培养技术(内因）基于动力学模型分析的优化和控制技术(外因，定量化）关键技术4在一个生物反应体系中基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）基于代谢通量分析的过程优化技术(内因，定量化）例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基于代谢特性基于动力学模型分析的优化和控制技术关键技术4在114本研究的主要内容

课题来源：江苏省高校高新技术产业发展项目“微生物发酵法生产谷胱甘肽”研究目标：酵母细胞和GSH的高产量、高得率和高生产强度研究内容：（6个部分）产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本研究的主要内容课题来源：江苏省高校高新技术产业发展项目“115产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件

谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件例子1产朊116碳源种类对谷胱甘肽发酵的影响

表2-1各种碳源对细胞生长及GSH合成的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽碳源种类对谷胱甘肽发酵的影响表2-1各种碳源对细胞生长117图2-2糖类碳源对细胞生长及GSH合成的影响

■Glucose;○Sucrose;◆Fructose例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图2-2糖类碳源对细胞生长及GSH合成的影响例子1产朊118氮源种类对谷胱甘肽发酵的影响

图2-3各种氮源对细胞生长及GSH合成的影响

□Beefextract;●Peptone;▲Yeastextract;■Urea;○(NH4)2SO4;◆NH4Cl;

NaNO3

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽氮源种类对谷胱甘肽发酵的影响图2-3各种氮源对细胞生长119混合氮源对谷胱甘肽发酵的影响

图2-4混合氮源（硫酸铵+尿素）对细胞生长及GSH合成的影响

Mixednitrogensourceconcentration:■6g·L-1;○8g·L-1;▲10g·L-1

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽混合氮源对谷胱甘肽发酵的影响图2-4混合氮源（硫酸铵+120KH2PO4和MgSO4对谷胱甘肽发酵的影响

图2-5不同浓度磷酸二氢钾和硫酸镁对GSH生物合成的影响■GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽KH2PO4和MgSO4对谷胱甘肽发酵的影响图2-5不121谷胱甘肽发酵的营养条件正交优化试验

表2-2L16(45)正交试验因素水平表

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽发酵的营养条件正交优化试验表2-2L16(4122表2-3正交试验数据及BP神经网络处理结果例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表2-3正交试验数据及BP神经网络处理结果例子1产朊假123图2-6正交试验结果直观分析

■GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent

以提高GSH产量为目的（即Y2最大化），通过直观分析图获得的较优化的营养条件组合为A2B3C2D4E2，即葡萄糖浓度30g·L-1，(NH4)2SO4浓度4g·L-1，尿素浓度4g·L-1，KH2PO4浓度3g·L-1，MgSO4浓度0.25g·L-1。这与BP神经网络预测的结果是一致的。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图2-6正交试验结果直观分析以提高GS124环境条件对谷胱甘肽发酵的影响

图2-7环境条件对C.utilisWSH02-08细胞生长及GSH合成的影响■GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽环境条件对谷胱甘肽发酵的影响图2-7环境条件对C.u125

C.utilisWSH02-08生产谷胱甘肽的摇瓶发酵过程

图2-8C.utilisWSH02-08摇瓶发酵生产GSH过程曲线●Residualglucose;

pH;■GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽C.utilisWSH02-08生产谷胱甘肽的摇瓶126摇瓶分批补糖方式对谷胱甘肽发酵的影响

表2-4摇瓶中不同补糖方式对GSH发酵的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽摇瓶分批补糖方式对谷胱甘肽发酵的影响表2-4摇瓶中不同127本章小结：1、确定了C.utilisWSH02-08发酵生产GSH培养基的营养成分及其浓度组合；2、以实现细胞的高产和GSH的高合成为目标，获得了较优的环境条件组合；3、摇瓶发酵结果表明，DCW最大值达9.0g·L-1，GSH最大浓度208.3mg·L-1，胞内GSH含量2.35%；4、总糖浓度固定的情况下，适当的补糖策略对GSH的合成有一定的促进作用。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽128产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件

谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学

流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件例子129溶氧对谷胱甘肽分批发酵的影响图3-1不同搅拌转速下发酵过程的溶氧变化趋势1—350r·min-1;2—300r·min-1;3—250r·min-1;4—200r·min-1

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽溶氧对谷胱甘肽分批发酵的影响图3-1不同搅拌转速下发酵130图3-2不同搅拌转速下的GSH分批发酵过程◆200r·min-1;■250r·min-1;

△300r·min-1;

○350r·min-1

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-2不同搅拌转速下的GSH分批发酵过程例子1产朊假丝131不控制pH的谷胱甘肽发酵过程图3-3不同pH控制方式下GSH发酵过程曲线□glucose;■DCW;▲extracellularGSH;△intracellularGSH;○pH;◆totalGSH;●intracellularGSHcontent;PanelA-C,nopHcontrol;PanelD-F,pH5.5发现低pH培养环境下，产朊假丝酵母胞内合成的GSH大量向胞外渗漏例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽不控制pH的谷胱甘肽发酵过程图3-3不同pH控制方式下132控制恒定pH时的谷胱甘肽发酵过程图3-4不同恒定pH条件下GSH发酵各过程参数比较

□DCW;■

PGSH;

μ;◆

qP;△GSHcontent;▲GSHconcentration;○

YX/S;●

YP/S

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽控制恒定pH时的谷胱甘肽发酵过程图3-4不同恒定pH条133基于动力学模型解析pH对谷胱甘肽发酵的影响表3-2不同pH下GSH分批发酵动力学参数模拟结果

KI表示底物浓度对细胞生长的抑制程度，且KI值越高则抑制效应越低。

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基于动力学模型解析pH对谷胱甘肽发酵的影响表3-2不同134图3-5不同pH条件下GSH合成能力及细胞生长比较

pH为5.5时GSH总量达到最大，从动力学角度分析，是因为在这一pH下兼具了KI值高（底物对细胞生长的抑制效应小）、α值低和β值高（细胞生长过程中和生长结束后均可保持较高的比GSH合成速率）的特点。α为直线斜率，表示在μ相同的条件下，细胞合成GSH能力的强弱；β为截距，反映生长停止后（μ=0）细胞继续合成GSH能力的高低。

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-5不同pH条件下GSH合成能力及细胞生长比较α为135不同温度下的谷胱甘肽发酵过程分析图3-6不同温度条件下GSH发酵过程及动力学参数随时间变化情况●andcurve1,32ºC;□andcurve2,30ºC;▲andcurve3,28ºC;○andcurve4,26ºC;△andcurve5,24ºC例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽不同温度下的谷胱甘肽发酵过程分析图3-6不同温度条件下例136表3-3不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表3-3不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较例子1137细胞生长动力学模型及其参数估计表3-4不同温度下细胞生长动力学参数模拟结果

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽细胞生长动力学模型及其参数估计表3-4不同温度下细胞生138谷胱甘肽合成动力学模型及其参数估计表3-5不同温度下GSH合成动力学参数模拟结果

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽合成动力学模型及其参数估计表3-5不同温度下G139图3-7温度对C.utilisWSH02-08细胞生长动力学参数的影响及其模拟

不同温度和葡萄糖浓度下的细胞浓度随时间变化情况：例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-7温度对C.utilisWSH02-08细胞140图3-8C.utilisWSH02-08细胞生长动力学模型的验证A:Temperature29ºC,initialglucoseconcentration28.3g·L-1B:Temperature30ºC,initialglucoseconcentration33.2g·L-1

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-8C.utilisWSH02-08细胞生长动141分阶段温度控制策略的提出与实现表3-8不同温度下分批发酵8h前后的平均比生长速率和平均比GSH合成速率比较结果

例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽分阶段温度控制策略的提出与实现表3-8不同温度下分批发142