农杆菌介导法课件

农杆菌介导转化法

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。农杆菌介导转化法1农杆菌感染柳树产生冠瘿瘤农杆菌2原理：根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。原理：3因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的4农杆菌介导法课件5农杆菌介导法课件6Story冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面的根茎交界处，形似帽状而得名。1907年，Smith&Townsent

农杆菌诱发冠瘿瘤病。1947年，Braunetal.

证实俩者的关系，但发现有的菌株不致病。提出了假说：tumour-inducingprinciple,TIP.肿瘤诱导因子。60’s,肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine,nopaline）总称冠瘿碱（opine)。Petitetal.证实肿瘤组织合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP)Story71974年，Zaenenetal,Schell,VanLarebekeetal.从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒(tumorinducingplasmid)，称为Ti质粒。

Ti=TIP1977年，Chiltonetal.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存在外源的DNA,与Ti质粒的DNA有同源性，是整合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段，

T-DNA

(transferredDNA),其内有致瘤和冠瘿碱合成酶等基因。1981年，Oomsetal.发现Ti质粒上有致瘤区(virulenceregion)，Vir区。1974年，Zaenenetal,Schell,Va8Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子，长度约200kb，平均周长54.1－75.4um，分子质量为（90－150）×106Da。在温度低与30℃的条件下，Ti质粒可稳定地存在于根癌农杆菌细胞内。农杆菌介导法课件9农杆菌介导法课件10Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有以下几种重要功能：1、赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力；2、赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力；3、根癌农杆菌的寄主植物范围；4、决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分；5、参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素的代谢活。

Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有以111)Ti质粒的结构来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类胭脂碱(nopaline)类农杆碱（agropine）类。Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源和碳源。1)Ti质粒的结构12农杆菌介导法课件13长度：160-250kb6大功能区：1)致瘤区，这个区主要合成植物生长素和细胞分裂素；2)冠瘿碱合成区；3)冠瘿碱分解区；4)Ti质粒接合转移区(tra)；5)毒性区（Vir）；6)DNA复制区（Rep）。长度：160-250kb14在致瘤区、冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列，由这三部分所构成的DNA区域叫做T-DNA。致瘤区+冠瘿碱+左右边界=T-DNA插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T-DNA。T-DNA区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组后才能激活表达.T-DNA在致瘤区、冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列15T-DNA：Tms1、Tms2、Tmr这3个基因表达植物生长素和细胞分裂素,可调节植物细胞的生长和发育,它们的过量表达刺激植物细胞大量快速增长而形成冠瘿。冠瘿碱合成基因在宿主植物体内合并分泌出来,被Ti质粒上的冠瘿碱代谢基因分解成碳源和氮源，供根癌农杆菌生长所须。T-DNA：16脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp的重复序列,构成T-DNA的左边界和右边界。在某些章鱼碱型根癌农根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA是以两个分开的独立片段形式存在，即T-DNA左边区段和T-DNA右边区段。插入在T-DNA边界序列之间的任何DNA都可被转到植物染色体中。因此Ti质粒可用做外源目的基因的载体。脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp17

Vir区（Vir-region）：即毒性区。其长度约为35kb。控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞有关部位，与感染后冠瘿形成有关。Vir区位于T-DNA区左侧，包含义个毒性遗传点（virA、virＢ、virC、virＤ、virＥ和virG）。vir基因控制着Ｔ－ＤＮＡ的转移。virＥvirＤvirC

virG

virＢvirAVir区（Vir-region）：即毒性区。其长度约18农杆菌介导法课件19农杆菌介导法课件20农杆菌介导法课件21植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羟基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子22目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子，而使T-DNA可以成功的转入；而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区的基因，达到转基因的目的。目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。其中乙酰丁香23最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。virA基因——virG基因最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜24virD基因产物：virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得以释放。VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。virD基因产物：25农杆菌介导法课件26小结:植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羟基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。小结:27最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得以释放。VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。T-复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞膜及细胞壁。并进入植物细胞核，最终整合进入植物核基因组。T-DNA的转移机理比较复杂，依赖于T-DNA区和vir区共同参与，涉及多个基因表达及一系列蛋白质和核酸的相互作用。最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜28Table1SummaryofvirGeneProducts

Locus

Size(kb)

ORFsaProteinsSize(kDa)Locationb

FunctionvirA2.0190Mplantsignalsensor,proteinkinaseVirG1.0130CtranscriptionalactivatorVirD4.5416,47,21,75C/M?T-DNAborderendonuclease(VirD1andVirD2);pilotprotein?nuclearlocalization?(VirD2)VirC2.0226,23C?processingofT-DNA(VirC1)VirE2.027,60.5C/M?single-strandDNA-bindingprotein(VirE2)

virB9.51126,12,11,87,23,32,5.5,25,32,48,38MT-DNAtransferapparatus?Table1SummaryofvirG29③T-DNA加工和转移

Vir基因表达调控的问题，知道VirA和VirG基因诱导其它Vir基因的表达，当VirD操纵元的被诱导表达后，其中的VirD1和VirD2蛋白质具有核酸内切酶的活性(Yanofsky

M．F.

1986)，能够在T-DN

A边界重复序列的特异位点切开T-DNA单链，因此T-DNA往往以单链形式进入植物细胞。但是在植物细胞中也发现双链T-DNA分子。③T-DNA加工和转移30切刻位点(nick

site)可作为DNA从5’向3'合成的起始位点，新的DNA链合成后，T-DNA单链即被替换(displacement)释放出来(图2)。当然这种缺刻也可通过重组系统把T-DNA双链从Ti质粒上解离下来。切刻位点(nick

site)可作为DNA从5’向3'合成的31缺失研究也表明：右边界重复序列缺失后，T-DNA不能转移，而左边界重复序列的缺失会稍稍降低T-DNA转移频率(Timmerman

B．1988)，这进一步说明T-DNA单链是在从右边界到左边界5’向3‘替换合成中释放出来的。缺失研究也表明：右边界重复序列缺失后，T-DNA不能转移，而32右边界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能释放，所以T-DNA不能转移到植物细胞。而左边界的缺失，仅会影响DNA合成过程的终止，可能会降低导致T-DNA单链释放，而不会明显影响T-DNA单链的形成。右边界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能释放33可见T-DNA左边界序列作为合成DNA的起始位点的效率比右边界序列低。这种不同不是由于左右边界的24bp重复序列核苷酸不同，而是由于靠近右边界位置有一个转移增强子(transfer

enhancer；overdriver．Peralta

EG．1986)存在。这个T-DNA转移增强序列能极其明显的增加农杆菌中T-DNA链形成，并且这种作用与它的位置、方向及距离均无关系。增强子的缺失能够使农杆菌对宿主植物的毒性降低。Toro等人发现VirC1蛋白能特异性的结合这个增强子，VirC操纵元的突变也能导致农杆菌的毒性减弱。农杆菌介导法课件34当T-DNA单链进入植物细胞后，植物细胞如何处理这些单链DNA？Paul等

人利用电转移法把单链DNA转化到烟草原生质体中，结果表明，在植物细胞中，

单链DNA迅速转变成双链DNA分子。此外单链DNA比双链DNA的转化效率更

高。然而T-DNA分子并非以裸露的单链DNA形式进入植物细胞的。T-DNA单链

的5’端共价的结合着VirD2蛋白质，从而保护T-DNA分子免受外切核酸酶的降

解，此外VirD2蛋白质上含有核定位的序列，所以结合在T-DNA

5'端的VirD2

蛋白质象一个“导向仪”(pilot)指引并保护T-DNA进入植物细胞核中。VirE2蛋白

质是一种单链结合蛋白质，能够包裹T-DNA单链，和其它T-DNA结合蛋白质共

同构成了T-复合体。当T-DNA单链进入植物细胞后，植物细胞如何处理这些单链DN35冠瘿碱分解区冠瘿碱分解区36冠瘿也是在冠瘿碱胞内合并成分泌出来的,被冠瘿碱分解基因分解成根癌农杆菌生长所须的碳源和氮源。冠瘿也是在冠瘿碱胞内合并成分泌出来的,被冠瘿碱分解基因分解成37农杆菌介导转化法

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。农杆菌介导转化法38农杆菌感染柳树产生冠瘿瘤农杆菌39原理：根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。原理：40因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的41农杆菌介导法课件42农杆菌介导法课件43Story冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面的根茎交界处，形似帽状而得名。1907年，Smith&Townsent

农杆菌诱发冠瘿瘤病。1947年，Braunetal.

证实俩者的关系，但发现有的菌株不致病。提出了假说：tumour-inducingprinciple,TIP.肿瘤诱导因子。60’s,肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine,nopaline）总称冠瘿碱（opine)。Petitetal.证实肿瘤组织合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP)Story441974年，Zaenenetal,Schell,VanLarebekeetal.从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒(tumorinducingplasmid)，称为Ti质粒。

Ti=TIP1977年，Chiltonetal.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存在外源的DNA,与Ti质粒的DNA有同源性，是整合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段，

T-DNA

(transferredDNA),其内有致瘤和冠瘿碱合成酶等基因。1981年，Oomsetal.发现Ti质粒上有致瘤区(virulenceregion)，Vir区。1974年，Zaenenetal,Schell,Va45Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子，长度约200kb，平均周长54.1－75.4um，分子质量为（90－150）×106Da。在温度低与30℃的条件下，Ti质粒可稳定地存在于根癌农杆菌细胞内。农杆菌介导法课件46农杆菌介导法课件47Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有以下几种重要功能：1、赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力；2、赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力；3、根癌农杆菌的寄主植物范围；4、决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分；5、参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素的代谢活。

Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有以481)Ti质粒的结构来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类胭脂碱(nopaline)类农杆碱（agropine）类。Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源和碳源。1)Ti质粒的结构49农杆菌介导法课件50长度：160-250kb6大功能区：1)致瘤区，这个区主要合成植物生长素和细胞分裂素；2)冠瘿碱合成区；3)冠瘿碱分解区；4)Ti质粒接合转移区(tra)；5)毒性区（Vir）；6)DNA复制区（Rep）。长度：160-250kb51在致瘤区、冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列，由这三部分所构成的DNA区域叫做T-DNA。致瘤区+冠瘿碱+左右边界=T-DNA插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T-DNA。T-DNA区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组后才能激活表达.T-DNA在致瘤区、冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列52T-DNA：Tms1、Tms2、Tmr这3个基因表达植物生长素和细胞分裂素,可调节植物细胞的生长和发育,它们的过量表达刺激植物细胞大量快速增长而形成冠瘿。冠瘿碱合成基因在宿主植物体内合并分泌出来,被Ti质粒上的冠瘿碱代谢基因分解成碳源和氮源，供根癌农杆菌生长所须。T-DNA：53脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp的重复序列,构成T-DNA的左边界和右边界。在某些章鱼碱型根癌农根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA是以两个分开的独立片段形式存在，即T-DNA左边区段和T-DNA右边区段。插入在T-DNA边界序列之间的任何DNA都可被转到植物染色体中。因此Ti质粒可用做外源目的基因的载体。脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp54

Vir区（Vir-region）：即毒性区。其长度约为35kb。控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞有关部位，与感染后冠瘿形成有关。Vir区位于T-DNA区左侧，包含义个毒性遗传点（virA、virＢ、virC、virＤ、virＥ和virG）。vir基因控制着Ｔ－ＤＮＡ的转移。virＥvirＤvirC

virG

virＢvirAVir区（Vir-region）：即毒性区。其长度约55农杆菌介导法课件56农杆菌介导法课件57农杆菌介导法课件58植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羟基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子59目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子，而使T-DNA可以成功的转入；而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区的基因，达到转基因的目的。目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。其中乙酰丁香60最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。virA基因——virG基因最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜61virD基因产物：virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得以释放。VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。virD基因产物：62农杆菌介导法课件63小结:植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羟基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。小结:64最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得以释放。VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。T-复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞膜及细胞壁。并进入植物细胞核，最终整合进入植物核基因组。T-DNA的转移机理比较复杂，依赖于T-DNA区和vir区共同参与，涉及多个基因表达及一系列蛋白质和核酸的相互作用。最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜65Table1SummaryofvirGeneProducts

Locus

Size(kb)

ORFsaProteinsSize(kDa)Locationb

FunctionvirA2.0190Mplantsignalsensor,proteinkinaseVirG1.0130CtranscriptionalactivatorVirD4.5416,47,21,75C/M?T-DNAborderendonuclease(VirD1andVirD2);pilotprotein?nuclearlocalization?(VirD2)VirC2.0226,23C?processingofT-DNA(VirC1)VirE2.027,60.5C/M?single-strandDNA-bindingprotein(VirE2)

virB9.51126,12,11,87,23,32,5.5,25,32,48,38MT-DNAtransferapparatus?Table1SummaryofvirG66③T-DNA加工和转移

Vir基因表达调控的问题，知道VirA和VirG基因诱导其它Vir基因的表达，当VirD操纵元的被诱导表达后，其中的VirD1和VirD2蛋白质具有核酸内切酶的活性(Yanofsky

M．F.

1986)，能够在T-DN

A边界重复序列的特异位点切