术中快速冰冻切片质量的影响因素及常见问题分析

术中快速冰冻切片质量

的影响因素及常见问题分析

医院病理科术中快速冰冻切片检查是目前最快速、难度系数最大、医疗安全风险最高的诊断之一。但对手术患者在术中快速诊断具有重要的作用。科研及免疫组化研究（特别是肾脏穿刺免疫荧光染色、酶组织化学染色）中占据重要的作用。准确快急患者在手术台等候，临床需要病理科结果做决策病理技术人员制片的流畅病理诊断医生精确的诊断为了降低快速病理诊断的风险，保证其准确性，技术人员必须保证作出一张合格的冰冻切片。何为术中快速冰冻切片？采用物理降温方法将组织迅速冷冻后切成薄片的过程，再经过固定、苏木精-伊红染色、封片，显微镜镜检。合格的冰冻切片？细胞结构清晰、无人为退变操作流程规范染色核浆分明、红蓝适度切片完整、厚薄均匀、无皱褶、无刀痕、无冰晶合格切片应具备的因素一、规范的制片操作1、取材的厚度2、包埋剂量、冷冻速度3、切片熟练程度4、固定及时、染色清晰二、合格的试剂及染液1、固定液类型2、苏木精及伊红染液类型取材后组织迅速放置于冷冻切片机速冻台上的标本托（标本托在放置组织之前加适量包埋剂），添加包埋剂，待组织冷冻住1/3后放上冷冻锤。速冻将冻好的组织移到切片机夹头内夹紧，修片至适度面，即可切片，切好的组织薄片（4-6um），黏贴在编号的载玻片后立即放入固定液（95%乙醇）固定30s-1min。切片1.自来水稍洗；2.改良Carazzi苏木精染色50s-1min）；3.稍水洗，碳酸锂水溶液蓝化15s；4.1%水溶性伊红染色20s；5.稍水洗。染色1.80%酒精、95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、无水酒精Ⅰ、无水酒精Ⅱ逐级脱水；2.二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明；3.中性树胶封固，贴附标签。封固冰冻切片染色流程冰冻切片质量的影响因素及分析一、取材（1-1.5）cmX（1-1.5）cmX0.4cm骨组织、钙化组织不做冰冻切片组织会过厚延长冷冻速度、易出现冰晶组织必须是新鲜未固定（特别是乙醇）二、包埋大多数采用OCT，也可用普通胶水。胶水太稀，会延长冷冻时间，胶水太稠，标本与样本头容易脱开且易粘附于玻片上不容易洗掉，过多易影响冷冻速度。OCT包埋剂与普通胶水性能？包埋剂粘附在组织及玻片处理办法：1、组织贴片后立即进行固定，切勿等待切片干燥后固定。2、苏木精染色之前进行水洗。三、冷冻速度速冻是减少组织内产生冰晶最为关键的步骤冰晶少、体积大对组织的观察影响较小，反之影响较大。冰晶形成的数量越多则越小，对组织结构影响越明显。组织冷冻速度慢对组织的影响速度↑，组织内冰晶↓组织速冻的要点：标本托放在冷冻切片机速冻台预冷。组织取材厚度越厚。冷冻速冻越慢，越容易出现冰晶，一般不超过0.4cm。组织冷冻住1/3后轻轻放上冷冻锤。切片速度越快，冰晶越不容易出现。包埋剂越多，冷冻速度越慢，须适量。子宫肌瘤乳腺冷冻速度较慢：组织形态结构改变冷冻的速度速度↑，组织内冰晶↓子宫肌瘤肝脏冷冻的速度速度↑，组织内冰晶↓关于冰晶的形成含水分较多的组织在冷冻时凝固形成球形的冰晶，挤压纤维组织而产生条索状形态冰晶，挤压纤维组织条而产生泡沫样的形状。核内冰晶细胞核产生冰晶的趋势不一，与组织自身的类型有关，细胞核水肿、囊状的核，核冰晶形成的机率越大。片子切得越薄，这种冰晶越容易留下空洞。

子宫内膜癌乳腺肿瘤关于冷冻切片机温度的控制组织的温度变化影响本身软硬程度。对于不同组织温度调节的原则：柔软稚嫩富含水分的组织选择相对较高的温度（脑组织、肾脏等），较低的温度易造成切片呈碎屑状；较为致密富含脂肪组织选择相对较低的温度，较高的温度易造成切片堆积不能现成片状。部分组织的参考温度-13°C—-16°C：脑组织、脾脏、肝脏、子宫内膜、直肠等组织-16°C—-25°C：肺、小肠、宫颈、卵巢、前列腺、乳腺、子宫、甲状腺等组织冷冻切片机温度控制样本头的控制：根据组织质地进行调节。

即使箱体温升高，组织常能稳定在设定的

温度，切片几乎不受影响箱体温度：样本头不带制冷功能箱体温度尤为重要。组织冻过度后发脆时

，可将组织拿到箱体外复温几秒，再进行

切片，也可用手放在组织切面上稍做加温

后再切，都可改善切片质量。四、锋利的切片刀新、质量好、锋利的刀片是切出高质量切片的前提条件。质地较硬、钙化组织、切片出现刀痕、质量下降应该立即更换另外一个刀口进行切片。锋利刀片的判断：将一次性刀片放入显微镜下观察，刀口平整为锋利，刀口有凹凸不平表明刀质量差。五、毛笔/毛刷毛笔作用：粘住组织并将其平整展在台面，利于贴出一张完整的切片。毛刷以硬尖头为佳。柔软毛笔不易拉住组织切片，且毛的脱落影响贴片。×√五、切片首先初切，将组织修至适度平面，在连续转动切片机手轮5个左右切面，然后开始切片。切片步骤在无防卷板情况下，需要手轮与毛笔的合理的配合才能切出一张完整的切片。切片机手轮与毛笔的配合切片时必须以连续均匀的速度进行旋转切片机手轮。不可手握着毛笔在开始切片时停一下，缓慢的抓取组织，然后再开始转动手轮，此动作会增加切片增厚，厚薄不均匀。毛笔只需要轻轻拉住包埋剂的一角，恰当的进行配合，才能够切出一张完美的切片。皱褶对组织的影响防卷板的利用利用好防卷板能够获得平整、完整的切片防卷板正确位置：与切片刀刃平行并微略突出少许，突出过度会造成切片机头上的组织与防卷板相撞，过于低于刀刃会造成切片向上卷曲不能形成平整的切片。冰冻切片组织厚度常规手术病理一般4-6um，脂肪组织8-10um。厚度在5um完全满足切片的观察，切片过于薄，组织不易上色，高倍镜下观察显得苍白，容易忽略一些细节。5um的片子可以有更多的时间去避免风干假象，也会减少冰晶所造成的细胞核空洞。组织的切片方向1、调整好组织切片的方向对于顺利切片很重要，才能够很顺利而又快速的切出薄片。2、含脂肪组织一般最后接触刀片，如先切到组织中的脂肪，整个切片都不易切出。组织的初修1、初修以病变为主，不要追求组织的最大切面（许多甲状腺微小肿瘤可能多修一刀病变就修完）。2、冰冻与石蜡切片的一致性。六、贴片采用从切片机台面或者直接在组织面粘贴组织薄片。用于粘附组织的玻片摆放于室温，切勿提前放入切片机内冷冻。贴片时手切勿抖动，抖动易拉扯到组织。玻片必须洁净，防止组织出现皱褶及气泡而发生掉片。七、固定贴片后立即将切片放入固定液中固定固定不及时容易造成细胞核的退变切记勿采用电吹风或酒精灯加热固定有时需要观察组织切全与否的程度，不可贴片后对着光观察，应该稍作固定再进行观察固定不及时与及时固定液甲醇乙酸液（97ml甲醇+3ml乙酸）95%乙醇乙酸液（97ml95%乙醇+3ml乙酸）95%乙醇液固定液有很多种，95%乙醇及甲醇乙酸固定液对细胞核作用快，收缩小，染色较清晰，是冷冻切片首选的固定液，时间为30秒-1分钟。（左侧上唇）基底细胞癌肾脏八、水洗水洗作用在于洗去固定液、洗去包埋剂，所以固定必须及时，不能等到切片干燥后固定，这样很难洗去包埋剂，同时细胞容易造成退变。九、苏木精-伊红染液1.改良Carazzi苏木精（冰冻切片专用苏木精）①2g无水苏木精+10ml无水乙醇+甘油至100ml，充分混合②23.01g硫酸铝钾+390ml蒸馏水③0.2g碘酸钠+10ml蒸馏水将①+②液充分混合+③液，充分混匀后放置片刻即可使用。此苏木精无需分化，缩短了染色的同时，防止了组织掉片。2.伊红1%伊红水溶液较好控制。着色较为均匀。（首选）醇溶性伊红上色较快（3-5秒），不易控制。常上色不均匀。十、对于质地不同组织的处理办法1、脂肪组织，特别是淋巴结、乳腺癌小肿块周围的大量脂肪组织，一般意义不大。2、软骨组织、皮肤组织、胶质、结缔组织丰富的组织，在染色时都容易卷起或脱片，切片切得薄一点非常重要，用带正电荷载玻片粘片也可以减少切片卷起或脱片的概率。3、皮肤组织：表皮朝上，真皮朝下，先切较软的部分，依次切真皮，表皮，同时用毛笔轻轻展开切片。一张冰冻切片的质量体现出一个技术人员的态度十一、冰冻切片质量要求1.操作流程规范、速冻及固定及时2.切片完整、厚薄均匀、无皱褶、无刀痕、无冰晶3.染色核浆分明、红蓝适度4.组织透明度好、封裱美观5.单件标本冰冻切片制片总时间在15分钟内病理专业医疗质量控制指标（2015年版）单例标本术中快速病理诊断报告在收到标本后30分钟内完成。若前一例标本术中快速病理诊断报告未完成，新标本术中快速病理诊断报告在收到标本后45分钟内完成乳腺肾脏十二、冰冻切片-感染控制新鲜组织携带病原菌易造成感染、职业暴露切片机的消毒——熏蒸消毒：福尔马林、乙醇紫外线消毒：紫外线照射个人防护——戴口罩、手套、勤洗手十三、冷冻切片机的维护、保养1、严格按照操作规程操作。2、每天切片完成后，及时清洁机器内组织碎屑。3、双压缩切片机完成切片后可将速冻台压缩机关闭。4、冷冻切片机应长期处于恒温制冷状态，经常地开关

机器电源，容易造成压缩机损伤。十四、冷冻切片易出现的问题及其解决办法1、组织在染色过程中出现掉片原因：组织切片过厚、组织质地过硬；蓝化液浓度过高；玻片不洁净等。解决办法：切片厚度在适度范围内；对于质地较硬组织采用防脱玻片贴片。蓝化液一般选用1%碳酸锂为佳。贴片的玻片采用洁净、新的玻片。冰冻切片几个常见问题的分析2、细胞核发生严重退变原因：切片未及时固定，切片在空气中干燥（特别是室温高的情况下退变更为明显）；贴片后采用加热（电吹风、加热等方法<细胞核上色也容易淡>）切片后加固定液。解决办法：切片后及时固定。固定液采用甲醇、乙醇为佳，固定时间需在30秒-1分钟左右。3、切片中冰晶较多影响观察原因：组织取材过厚；冷冻速度过慢（缓慢的冷冻速度能够使组织间的水分子游离、聚集，然后凝结成冰）；切片速度过慢。解决办法：组织取材不超过0.4cm。应用冷冻锤、速冻头、切记组织托一定要放入切片机速冻台。对于切片而言：切出一张完整、厚薄均匀切片即可，不要过于追求完美的切片。组织托放入速冻台易出现的一个问题组织冷冻后切片时整块组织容易脱离组织托，特别是质地较硬的组织很明显。解决办法：若采用普通胶水，可将胶水进行稀释再进行使用。OCT包埋剂也可将其稀释。即可解决。颗粒状比螺旋式更加不易脱落4、组织发脆，导致切片破碎原因：质地较脆组织较易出现,温度过低、冷冻过度。组织较硬，导致切片困难。解决办法：调整冷冻切片机箱体温度或冷冻头温度。组织可拿到室温几秒再放回机器内切片、用手摸一下组织切面也会有改善。对组织切片不加以掌握5、组织细胞核不容易上色、上色较浅原因：切片太过于薄；苏木精染色时间过短、贴片后采用电吹风