EMSA原理流程纲要大纲

EMSA原理流程纲领纲领EMSA原理流程纲领纲领EMSA原理流程纲领纲领凝胶迁徙或电泳迁徙率实验〔EMSA〕能够：〔1〕研究DNA联合蛋白和其有关的DNA联合序列互相作用；〔2〕可用于DNA定性和定量分析；〔3〕用于研究RNA联合蛋白和特定的RNA序列的互相作用。实验方法原理凝胶迁徙或电泳迁徙率实验〔EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay〕是一种研究DNA结

合蛋白和其有关的DNA联合序列互相作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最先用于研究DNA联合蛋白，当前已用于研究RNA联合蛋白和特定的RNA序列的互相作用。平常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标志的DNA或RNA探针一起保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分别复合物和非联合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非联合的探针挪动得慢。同位素标志的探针依研究的联合蛋白的不一样样，但是双链或许是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA联合蛋白，可用纯化蛋白，局部纯化蛋白，或核细胞抽提液。在

检测RNA联合蛋白时，依照目的RNA联合蛋白的地点，可用纯化或局部纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采纳含蛋白联合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段〔特异〕，和其余非有关的片段〔非特异〕，来确立DNA或RNA联合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依照复合物的特色和强度来确立特异联合。试剂、试剂盒[γ-32P]ATPT4多聚核苷酸激酶Nuclease-FreeWaterT4多聚核苷酸激酶缓冲液醋酸铵TE无水乙醇TBEbuffer重蒸水甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺甘油过硫酸铵TEME〔D四甲基乙二胺〕EMSAGel-Shift联合缓冲液溴酚蓝仪器、耗材水浴锅PCR仪离心计电泳仪电泳槽实验步骤一、探针的标志1.?以下设置探针标志的反应系统：〔1〕待标志探针(1.75pmol/微升)：2微升。〔2〕T4PolynucleotideKinaseBuffer(10X)：1微升。〔3〕Nuclease-FreeWater：5微升。〔4〕[γ-32P]ATP(3000Ci/mmolat10mCi/ml)：1微升。〔5〕T4PolynucleotideKinase(5-10u/微升)：1微升。

〔6〕整体积10微升〔7〕依照上述反应系统挨次参加各样试剂，参加同位素后，Vortex混匀，再参加T4PolynucleotideKinase，混匀。2.?使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。3.?参加1微升探针标志停止液，混匀，停止探针标志反应。4.?再参加89微升TE，混匀。此时能够取少许探针用于检测标志的效率。平常标志的效率

在30%以上，即总放射性的30%以上标志到了探针上。为实验简单起见，平常不用测定探针的标志效率。5.?标志好的探针最好立刻使用，最长使用时间一般不宜超出3天。标志好的探针能够保留在-20℃。二、探针的纯化平常为实验简单起见，能够不用纯化标志好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改良EMSA的电泳结果。如需纯化，能够依照以下步骤操作：1.?关于100微升标志好的探针，参加1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再参加2体积即200微升的无水乙醇，混匀。2.?在-70℃至-80℃积淀1小时，或在-20℃积淀留宿。3.?在4℃，12000g-16000g离心30分钟。当心去除上清，切不能够涉及沉。4.?在4℃，12000g-16000g离心1分钟。当心吸去节余液体。微晾干积淀，但不宜过分干燥。5.?参加100微升TE，完满溶解积淀。标志好的探针最好立刻使用，最长使用时间一般不宜超出3天。标志好的探针能够保留在-20℃。

三、EMSA胶的配制1.?准备好倒胶的模具。能够使用常例的灌制蛋白电泳胶的模具，或其余适合的模具。最好选择能够灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为获得更好的结果，能够选择可灌制较大EMSA胶的模具。2.?依照以下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不一样样比率的Acr/Bis

对结果影响不大)。〔1〕TBEbuffer(10X)：1毫升。

重蒸水16.2毫升。〔2〕39:1acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)：2毫升。〔3〕80%甘油：625微升。〔4〕10%过硫酸铵(ammoniumpersulfate)：150微升。〔5〕TEMED：10微升3.?依照上述序次参加各个溶液，参加TEMED前先混匀，参加TEMED后立刻混匀，并立刻参加到制胶的模具中。防备产生气泡，并加上梳齿。假如发现特别简单形成气泡，能够把一块制胶的玻璃板进行硅烷化办理。四、EMSA联合反应1.?以下设置EMSA联合反应阴性比较反应：(1〕Nuclease-FreeWater：7微升。〔2〕EMSA/Gel-Shift联合缓冲液(5X)：2微升。〔3〕细胞核蛋白或纯化的转录因子：0微升。〔4〕标志好的探针：1微升。〔5〕整体积：10微升。样品反应：〔1〕Nuclease-FreeWater：5微升。〔2〕EMSA/Gel-Shift联合缓冲液(5X)：2微升。〔3〕细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。

〔4〕标志好的探针：1微升。〔5〕整体积：10微升。探针冷竞争反应：〔1〕Nuclease-FreeWater：4微升。〔2〕EMSA/Gel-Shift联合缓冲液(5X)：2微升。〔3〕细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。〔4〕未标志的探针：1微升。

〔5〕标志好的探针：1微升。〔6〕整体积：10微升。突变探针的冷竞争反应：〔1〕Nuclease-FreeWater：4微升。〔2〕EMSA/Gel-Shift联合缓冲液(5X)：2微升。〔3〕细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。〔4〕未标志的突变探针：1微升。〔5〕标志好的探针：1微升。〔6〕体积：10微升Super-shift反应：〔1〕Nuclease-FreeWate：r4微升。〔2〕EMSA/Gel-Shift联合缓冲液(5X)：2微升。

〔3〕细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。〔4〕目的蛋白特异抗体：1微升。〔5〕标志好的探针：1微升。〔6〕整体积：10微升。2.?依照上述序次挨次参加各样试剂，在参加标志好的探针前先混匀，而且室温(20-25℃)放

置10分钟，进而除去可能发生的探针和蛋白的非特异性联合，或许让冷探针优先反应。此后参加标志好的探针，混匀，室温(20-25℃)搁置20分钟。3.?参加1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立刻上样。注意：有些时候

溴酚蓝会影响蛋白和DNA的联合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。假如关于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到没法上样，能够在无色上样缓冲液里面增添很少许的蓝色的上样缓冲液，至能察看到蓝颜色即可。五、电泳分析1.?用0.5XTBE作为电泳液。依照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候假如有空余

的上样孔，能够参加少许稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以察看电压能否正常进行。2.?把混淆了上样缓冲液的样品参加到上样孔内。在节余的某个上样孔内参加10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于察看电泳进行的状况。3.?依照10V/厘米的电压电泳。保证胶的温度不超出30℃，假如温度高升，需要适合降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。4.?剪一片大小和EMSA胶大小周边或略大的比较厚实的滤纸。当心取下夹有EMSA胶的胶

板，用吸水纸或一般厕纸大概擦干胶板边沿的电压液。当心打开两块胶板中的上边一块(注：平常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧渐渐覆遮住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶轻轻浸润后(大概缺少1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上边覆盖一层保鲜膜，保证保鲜膜和胶之间没有气泡。5.?干胶仪器上无聊EMSA胶。此后用X光片压片检测，或用其余适合仪器设施检测。其余一、常有问答1.什么是凝胶迁徙或电泳迁徙率实验？凝胶迁徙或电泳迁徙率实验〔EMSA〕是一种研究DNA联合蛋白和其有关的DNA联合序列互相作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最先用于研究DNA联合蛋白，当前已用于研究RNA联合蛋白和特定的RNA序列的互相作用。平常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标志的DNA或RNA探针一起保温，在非变性

的聚丙烯凝胶电泳上，分别复合物和非联合的探针。DNA复合物或RNA复合物比非联合的探针挪动得慢。同位素标志的探针依研究的联合蛋白的不一样样，但是双链或许是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA联合蛋白，可用纯化蛋白，局部纯化蛋白，或核细胞抽提液。

在检测RNA联合蛋白时，依照目的RNA联合蛋白的地点，可用纯化或局部纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采纳含蛋白联合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段〔特异〕，和其余非有关的片段〔非特异〕，来确立DNA或RNA联合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依照复合物的特色和强度来确立特异联合。2.实验中需要用到什么试剂？凝胶迁徙实验需要的联合蛋白，可根源于纯化或局部纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。还必然制备同位素标志的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探针用32P和T4多核苷酸激酶来作尾端标志，同位素标志的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标志的核苷酸在体外合成。Promega企业的Riboprobe/sup系统〔a,b〕可用于同位素标志的RNA的体外合成，DNA5'末

端标志系统，用于制备DNA探针，联合反应所需的组分有：含盐的溶液〔氯化镁，氯化钠，或氯化钾〕、缓冲系统〔Tris-HCl或HEPES〕、还原剂〔DTT〕、甘油、非特异的竞争DNA〔poly〔dI:dC〕dI:dC〕，也可能含非离子去污剂。在联合蛋白和同位素标志的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分别复合物，随后将凝胶无聊并放射自显影，或用PhosphorImage/sup分析。3.凝胶迁徙实验系统供给了什么试剂？Promega企业供给一种凝胶迁徙实验系统检测DNA联合蛋白，系统可作为这种实验的一种阳

性比较。系统包含目的寡核苷酸，比较DNA联合蛋白，联合缓冲液，用于寡核苷酸探针末端标志所需的试剂。Core系统包含含重组AP2蛋白〔AP2抽提液〕的大肠杆菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是从表达AP2蛋白的大肠杆菌中提取的。其余，Core系统还含SP1同源寡核苷酸，凝胶迁徙联合缓冲液，和能作20次比较实验的HeLa核抽提液。Complete系统含其余5个双链寡核苷酸，分别是AP1、OCT1、CREB、NF-kB、TFIID联合位点的同源序列。这些寡核苷酸能够在尾端标志后用作特异性探针，或在竞争实验顶用作非特异性探针。4.成功进行凝胶迁徙实验，需要优化哪些要素？凝胶迁徙实验在理论上很简单也很迅速，但要成功地进行凝胶迁徙实验，需要优化一些参数，这主要受联合蛋白的根源和探针联合位点特色的影响。以下是需要优化的要素：抽提液的制备〔核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解〕，联合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲液的配方和pH，聚丙烯凝胶电泳的特色和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白，能否有协助因子〔比方锌，或镉等金属离子，或激素〕。总之，反应整体积应最小〔20μ〕l。为知足一般要求，联合缓冲液含4%甘油，1mMMgCl2，0.5mMEDTA，0.5mMDTT，50mMNaCl，10mMTris-HCl〔〕，0.05mg/mlpolydI:dC，或10mMHEPES〔〕，50mMKCl，1mMDTT，1mMEDTA，10%甘油，0.05mg/mlpolydI:dC可作为优化实验的初步。5.在DNA探针的选择上，要考虑哪些重要要素？目的DNA的长度应小于300bp，以有益于非联合探针和蛋白DNA复合物的电泳分别。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁徙实验顶用作探针。如目的蛋白已被判断，那么应用短的寡核苷酸片段〔约为25bp〕，这样联合位点可和其余因子的联合位点差别开。长

的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/加强子地区内的蛋白联合位点定位。随后可用DNaseI印迹对蛋白联合的特异地区在DNA序列水平上作出分析。6.用以下一些转录调理因子和HeLa细胞核抽提物可形成哪些复合物：AP1,AP2,CREB,NFkB,Oct1,Sp1,TFIID,TFIIB。当用HeLa细胞核抽提物作为联合蛋白的根源时，每1个转录调理因子和它有关的DNA同源序列联合形成特色型的联合形态。以下的文字描绘了每一个独自的转录调理因子，包含鉴识的同源序列，因子的大小，特定的联合条件，以及和HeLa细胞核抽提物可形成的复合物的数量。1．细胞核蛋白提取：取约8.8×106个HSC-T6细胞，5mlPBS/PhosphataseInhobitors冲刷，采集细胞。参加0.25ml1×Hypotonicbuffer重悬，冰浴15min；参加25μlNP-40，震荡10s；14000×g离心，30s，4℃；采集上清即胞浆蛋白，于‐70℃保留。将积淀重悬于50μlLysisbuffer〔含DTT和ProteaseInhibitorCocktail〕中，震荡10s；置于摇床中冰浴30min，150次/min；再次震荡30s，14000×g离心，10min，4℃；取上清即为核蛋白，于‐70℃保留，测定蛋白质浓度。2．寡核苷酸探针的标志和纯化:rat：NF-κB：5′AGTTGAGGG