茶树育种学第七章-生物技术在茶树育种中的应用课件

第七章：生物技术在茶树育种中的应用生物技术是以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计、构建、培育具有预期性状的新品种、新物种、新品系，以及与工程原理相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的综合技术体系。目前用于茶树育种的现代生物技术有组织培养和营养繁殖技术、花粉（药）培养和单倍体培育技术、原生质体培养和体细胞杂交技术、分子标记技术和转基因技术等。第七章：生物技术在茶树育种中的应用生物技术是以生命科学为基础1第一节：组织与器官培养一、组织与器官培养的概念和应用（一）组织与器官培养的概念将离体的植物体各种结构（如原生质体、细胞、组织、器官以及幼小植株）在无菌的人工环境中使其生长发育，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。（二）组织与器官培养的类型1、胚胎培育。指以胚及具有胚的器官作为外植体，在离体培养条件下，使其再生完整植株的技术。第一节：组织与器官培养一、组织与器官培养的概念和应用22、（狭义）组织培养。指以植物各部分的组织（如分生组织、表皮组织等）作为外植体的离体培养技术。3、器官培养。指以植物的某一器官的全部或部分器官原基作为外植体的离体培养技术。4、花粉与花药培养。指用未成熟的花粉或花药作为外植体的离体培养技术。5、细胞培养。指以能保持较好分散性的单细胞或很小的细胞团作为外植体的离体培养技术。6、原生质体培养。指以除去细胞壁而获得的原生质体作为外植体的离体培养技术。2、（狭义）组织培养。指以植物各部分的组织（如分生组织、表皮3（三）组织与器官培养在育种中的应用1、扩大变异范围。2、克服远缘杂交的一些障碍。3、获得体细胞杂种。4、倍性控制。5、快速无性繁殖。6、获得脱毒苗。7、种质资源的保存。8、作为外源基因转化的受体系统。（三）组织与器官培养在育种中的应用4二、培养的步骤与方法植物组织与器官培养的过程：无菌培养的建立→营养繁殖体的增殖→再分化→试管苗移栽大田。（一）无菌培养的建立1、取材（外植体）。注意取材时间、部位、消毒等技术环节。⑴未成熟胚及相关材料的取材和灭菌。⑵茎尖及相关材料的取材。⑶叶片取材。注意消除多酚类氧化而产生的褐变。二、培养的步骤与方法52、构建培养基。培养基由营养成分和生长成分构成，前者主要提供外植体发育所需的元素，后者主要是调节外植体的生长发育。构建培养基应注意两点：①必须保证外植体能够生存。②尽可能使外植体较快生长发育。最常用的培养基是MS培养基。（二）营养繁殖体的增殖营养繁殖体的增殖是指愈伤组织的增殖。外植体接种到培养基后，经过脱分化作用，形成一团分生细胞（愈伤组织），这团细胞不断分裂使营养繁殖体增殖。2、构建培养基。培养基由营养成分和生长成分构成，前者主要提供6（三）再分化（通过调节激素种类及比例）1、诱导腋芽发生。2、诱导产生不定芽。3、诱导体细胞胚发生。4、诱导根的发生。5、幼苗的驯化锻炼。（四）试管苗移栽大田。主要克服组织失水和病菌感染，保证移栽成活率。（三）再分化（通过调节激素种类及比例）7三、茶树组织与器官培养的概况早在20世纪60年代末，英国剑桥大学化学系开始了茶树幼茎切块培养，用以研究茶树咖啡碱合成途径。此后，各国研究人员也开始了对茶树组织与器官培养的研究，并取得了一些成果。莫典义和黄雁萍（1981）通过种胚培养获得完整植株；中村顺行（1985）培养子胚获得完整植株；刘德华（1990）培养子叶柄获得完整植株；土井芳宪培养茎切段获得完整植株；王毅军（1994）以茶树叶片为外植体，培养出完整的植株。尽管有很多成功的报道，但茶树是多年生木本植物，多酚类含量高，到目前为止，茶树组织和细胞培养技术平台还没有完善，还有很多技术障碍需要克服。三、茶树组织与器官培养的概况8第二节：花粉和花药培养与单倍体育种一、单倍体在植物育种上的作用1、单倍体植物的概念凡具有配子染色体数的植物称为单倍体植物。2、单倍体在植物育种上的作用⑴单倍体染色体加倍可获得纯合二倍体，这对常规杂交育种有极为重要意义。⑵有利于克服远缘杂交的不实性，培育出稳定的远缘杂种新类型。⑶与诱变育种相结合可加速育种进程。⑷作为外源基因转化的受体系统。第二节：花粉和花药培养与单倍体育种一、单倍体在植物育种上的作9二、花粉和花药培养技术（一）花药培养1、取材。关键是选取花粉处于一定发育期的花药。用醋酸洋红染色压片法镜检确定花粉的发育时期，当大多数细胞处在单核中、晚期时，是花药培养取材的最佳时期。2、灭菌。3、建立培养基并接种。在接种时注意彻底除去花丝部分和尽量避免损伤花药。4、脱分化和繁殖增殖。药室内侧分裂形成原胚多细胞团，再经球型胚、心脏型胚、鱼雷型胚等发育阶段，最后以胚状体形式突出于花药壁，再将胚状体细胞转移到另一培养基培养、增殖。二、花粉和花药培养技术105、再分化并形成幼苗。将增殖了的胚状体细胞（愈伤组织）转移到分化培养基上培养，分化出不定芽和根，最后形成单倍体试管苗。6、移栽。通过更换培养基，逐渐降低渗透压和生长素含量，直到幼苗的根、茎、叶生长都较正常和健壮时，移出进行沙培或土培。（二）花粉培养由于在花药培养中所获得的植株不只是来源于花粉，也来源于花药壁、绒毡层等不同部位的体细胞，结果造成所获得植株群体常常是一个既有单倍体，又有二倍体、甚至多倍体的混合群体，给以后的鉴定和利用带来一定困难。花粉培养则可以完全排除花药组织的干扰，使诱导形成的植株全部来源于单倍体的花粉，从而可省略对其鉴定的程序或可以直接利用。但花粉培养所要求的技术要比花药培养5、再分化并形成幼苗。将增殖了的胚状体细胞（愈伤组织）转移到11复杂，许多不明因素有待研究。花粉培养的全过程除了材料的选择和灭菌与花药培养基本相同外，还包括花粉的分离和培养两个步骤。花粉的分离常用自然散落法，培养常用浅层液体培养法。（三）影响花药及花粉培养的因素1、供体植株的基因型。一般地说，性状优良、生活力强的亲本的杂交后代的花药及花粉比较容易诱导形成单倍体植株。复杂，许多不明因素有待研究。122、培养基。培养基不仅影响到外植体能否生存，还影响到其生长速度和能否分化成完整的植株。主要的影响因素有：①营养成分。主要是无机盐和有机成分（如氨基酸、酵母提取液等），为外植体的生长发育提供碳源、氮源、微量元素等。②PH值。一般要求PH值在5。5~7之间。③蔗糖浓度。蔗糖浓度影响到培养基的渗透压。一般地说，开始培养时，蔗糖浓度要高些，以后逐步降低。2、培养基。培养基不仅影响到外植体能否生存，还影响到其生长速13④激素。激素的种类及浓度对花药及花粉的分化起着决定性作用。一般情况下。当生长素与细胞激动素的比值高时，有利长根；比值低时，有利长芽，比值适中时，继续长愈伤组织。3、小孢子发育阶段。只有具一定发育阶段的小孢子，才对外界刺激较为敏感。多数植物以单核期，特别是单核期的中后期比较敏感。4、供体植株的生理状态及培养前的预处理。预处理有低温处理、高温处理、离心处理、减压处理、渗透压处理、碳源饥饿处理、二氧化碳处理等。④激素。激素的种类及浓度对花药及花粉的分化起着决定性作用。一14三、单倍体植株的染色体加倍单倍体植株只有经过染色体加倍，使之成为纯合的二倍体可育植株，才能给育种工作者提供可选择的材料。目前单倍体植株的染色体加倍主要有以下三种途径：1、自然加倍。2、人工诱导加倍。主要用秋水仙碱处理。3、从愈伤组织再生二倍体植株。即利用单倍性细胞的不稳定特性，通过对单倍体植株的茎、叶等组织的再培养，可获得较高比例的加倍植株。三、单倍体植株的染色体加倍15四、单倍体植株及纯合二倍体植株的鉴定。一般是取植株根尖进行细胞学观察，将根尖用卡诺固定液固定，铁矾苏木精染色，制成石蜡切片或者涂片，在光学显微镜下可观察到染色体数目。5、茶树花药及花粉培养的成就。据报道，前苏联、印度、日本和我国的研究人员都对茶树花药及花粉培养进行了研究，最有影响的是陈振光等人（1981）用茶树花药培养，诱导出完整的试管苗和植株。四、单倍体植株及纯合二倍体植株的鉴定。一般是取植株根尖进行细16第三节：细胞培养及其突变体筛选一、单细胞培养单细胞培养是指从植株组织器官或愈伤组织游离出单细胞，在无菌条件下，使其再生完整植株的技术。（一）分离细胞的方法1、物理方法。先将植物组织器官等外植体接种到固体培养基上，让其形成质地松散的愈伤组织，再经过振荡、过滤、离心、沉淀而得到分散的细胞或细胞团。2、酶法（果胶酶和纤维素酶）。第三节：细胞培养及其突变体筛选一、单细胞培养17（二）单细胞培养方法1、液体浅层培养。2、微滴培养。3、平板培养。4、看护培养。5、条件培养。（三）培养细胞的密度及活力的测定1、起始培养的细胞密度。起始培养的细胞密度通常以1万至1亿个/毫升为宜。2、细胞活力的测定。测定方法主要有染色法，（二）单细胞培养方法18包括莹光素双醋酸盐染色法和酚藏花红染色法。3、植板率的测定。植板率的含义是每个平板接种细胞总数形成细胞团的百分率。即：植板率=（每平板形成的细胞团数÷每平板接种的细胞总数）×100%；其中，每平板接种的细胞总数=每毫升培养液中的细胞数目×该平板细胞培养液的毫升数。包括莹光素双醋酸盐染色法和酚藏花红染色法。19二、细胞突变体筛选（一）细胞突变体筛选的意义1、可在小规模的实验室中同时对大量细胞进行选择，节省人力、物力，而且不受环境条件的影响。2、筛选获得的突变体不会出现嵌合体，遗传稳定，易鉴定。（二）细胞突变体筛选的一般技术1、细胞材料的选择。要从再生能力强、染色体数目稳定性好、生长速度快的亲本细胞系中进行选择。另外，如果筛选突变体的目的是为获得能经有性生殖传代的植物，那么就应避免使用非整倍二、细胞突变体筛选20体的细胞作为选择的材料。2、诱发突变的方法①物理方法，如用紫外线、放射线处理。②化学方法，即使用化学诱变剂，如甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）和5-溴去氧尿嘧啶核苷等多种有机物以及一些简单无机化合物．③突变细胞的选择方法Ａ、直接选择。如在培养基中某些重金属离子，若能生存，说明是耐高浓度重金属离子的突变体细胞。Ｂ、间接选择。如在培养基中加入羟基脯氨酸，可选择耐旱性突变细胞。体的细胞作为选择的材料。21（三）突变性状的遗传基础及其稳定性鉴定让细胞或组织在没有选择剂的培养基上继代培养几代，如果仍能表现选择出来的变异性状的，便可基本确定为突变细胞或组织。也可用再生的植株开花结实后所获得的发芽种子或用种子长成的植株为材料，进一步诱导其形成愈伤组织，将这些愈伤组织转移到含有选择剂的培养基上进行培养，如果仍能表现变异性状的，即可认为这些再生植株为变异植株。（三）突变性状的遗传基础及其稳定性鉴定22（四）农业上有用性状的突变体离体筛选１、抗病性筛选。常用活菌选择剂和病菌毒素选择剂进行筛选。２、对除草剂抗性的筛选。３、对温度的抗耐性的筛选。（四）农业上有用性状的突变体离体筛选23第四节：原生质体培养与体细胞杂交一、原生质体和体细胞杂交的概念１、原生质体：植株原生质体是指除去细胞壁由质膜包裹着的具有生活力的植株裸细胞。２、体细胞杂交：指使不同植物的原生质体相互融合形成杂种细胞，再经过人工培养诱导杂种细胞分化形成植株的过程。二、原生质体的分离（一）分离原生质体的材料。常用叶肉组织、无菌苗的子叶以及由植物组织器官形成的愈伤组织及悬浮细胞。第四节：原生质体培养与体细胞杂交一、原生质体和体细胞杂交的概24（二）原生质体的分离１、材料的预处理。目的使游离的原生质体能适应新的培养条件。⑴预培养。⑵暗处理。⑶药物或添加剂处理。⑷萎焉处理。⑸更新培养基。２、原生质体的分离。常用酶法分离。３、原生质体活力的检测：把原生质体放入略微（二）原生质体的分离25降低渗透压的培养基中，那些在分离时缩小体型又能恢复原状的原生质体是具有活力的。二、原生质体的培养（一）培养基本及培养条件除选择适当的培养基外，还应注意以下问题：１、植物激素。２原生质体的密度。一般采用1千个/毫升以上的密度。３、光照和温度。降低渗透压的培养基中，那些在分离时缩小体型又能恢复原状的原生26（二）原生质体的培养方法。常用液体浅层培养和平板培养两种方法。（三）原生质体的培养过程体积增大→细胞壁再生→细胞分裂→愈伤组织→再分化→幼苗。三、原生质体的融合（一）原生质体的融合的类型１、自发融合。指植物组织和细胞在用酶分离原生质体过程中，同种原生质体自然融合，形成同核体。（二）原生质体的培养方法。常用液体浅层培养和平板培养两种方法27２、诱导融合。指分离原生质体以后，通过加入诱导剂或其它方法促进不同亲本的异种原生质体之间发生融合的过程。异种原生质体之间能否真正融合，在很大程度上处决原生质体之间的亲缘关系和生理状态。（二）诱导融合的方法１、物理方法。有离心法、振动法、电刺激法。常用后者。2、化学方法。⑴高PH高钙法。２、诱导融合。指分离原生质体以后，通过加入诱导剂或其它方法促28⑵多聚化合物法。常用聚乙二醇（PEG）。PEG是相邻原生质体表面间的分子桥，有很强的凝聚作用，当PEG分子被高钙、高PH洗脱时，可能引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，从而促进融合。四、原生质体融合体的发育及杂种细胞的筛选（一）原生质融合体的生长发育1、异核体的壁再生。2、异核体的核融合。异核体的核能否融合。在很大程度上取决于原生质体之间的亲缘关系，亲缘关系近的原生质体在细胞减数分裂时能同步分裂⑵多聚化合物法。常用聚乙二醇（PEG）。29而使核融合。3、融合细胞的增殖。4、愈伤组织的器官分化，形成幼苗。（二）杂种细胞的筛选在细胞水平上进行杂种细胞的筛选，目的是杂种细胞提供良好的生长环境，以保护和促进其生长发育。筛选的方法有很多。如培养基促进异核体的选择方法；叶绿素缺失互补选择法；生化突变体互补选择法；双突变系选择法；莹光标记选择法等。这些方法有一定效果，也有一定局限性。而使核融合。30五、体细胞杂种植株的鉴定1、形态学鉴定。即根据植株的表现型特征来鉴定体细胞杂种。2、细胞学鉴定。即根据细胞中染色体数目、大小、与形态来鉴定细胞杂种。3、生化鉴定。即利用亲本的某些生物化学特性在杂种中的表达来鉴别体细胞杂种。4、DNA检测鉴定。即应用分子检测技术，从分子水平来鉴定体细胞杂种。五、体细胞杂种植株的鉴定31思考题：1、什么是体细胞杂交？简述体细胞杂交的步骤。2、体细胞杂种植株的鉴定方法有哪些？各有什么特点？3、什么是单倍体植物？单倍体茶树对于茶树育种来说有何意义？4、成熟和完善的组织和器官培养体系对育种有何意义？目前利用组织和器官培养体系进行茶树育种有何困难？5、影响茶树花药培养的主要因素有哪些？思考题：32第七章：生物技术在茶树育种中的应用生物技术是以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计、构建、培育具有预期性状的新品种、新物种、新品系，以及与工程原理相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的综合技术体系。目前用于茶树育种的现代生物技术有组织培养和营养繁殖技术、花粉（药）培养和单倍体培育技术、原生质体培养和体细胞杂交技术、分子标记技术和转基因技术等。第七章：生物技术在茶树育种中的应用生物技术是以生命科学为基础33第一节：组织与器官培养一、组织与器官培养的概念和应用（一）组织与器官培养的概念将离体的植物体各种结构（如原生质体、细胞、组织、器官以及幼小植株）在无菌的人工环境中使其生长发育，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。（二）组织与器官培养的类型1、胚胎培育。指以胚及具有胚的器官作为外植体，在离体培养条件下，使其再生完整植株的技术。第一节：组织与器官培养一、组织与器官培养的概念和应用342、（狭义）组织培养。指以植物各部分的组织（如分生组织、表皮组织等）作为外植体的离体培养技术。3、器官培养。指以植物的某一器官的全部或部分器官原基作为外植体的离体培养技术。4、花粉与花药培养。指用未成熟的花粉或花药作为外植体的离体培养技术。5、细胞培养。指以能保持较好分散性的单细胞或很小的细胞团作为外植体的离体培养技术。6、原生质体培养。指以除去细胞壁而获得的原生质体作为外植体的离体培养技术。2、（狭义）组织培养。指以植物各部分的组织（如分生组织、表皮35（三）组织与器官培养在育种中的应用1、扩大变异范围。2、克服远缘杂交的一些障碍。3、获得体细胞杂种。4、倍性控制。5、快速无性繁殖。6、获得脱毒苗。7、种质资源的保存。8、作为外源基因转化的受体系统。（三）组织与器官培养在育种中的应用36二、培养的步骤与方法植物组织与器官培养的过程：无菌培养的建立→营养繁殖体的增殖→再分化→试管苗移栽大田。（一）无菌培养的建立1、取材（外植体）。注意取材时间、部位、消毒等技术环节。⑴未成熟胚及相关材料的取材和灭菌。⑵茎尖及相关材料的取材。⑶叶片取材。注意消除多酚类氧化而产生的褐变。二、培养的步骤与方法372、构建培养基。培养基由营养成分和生长成分构成，前者主要提供外植体发育所需的元素，后者主要是调节外植体的生长发育。构建培养基应注意两点：①必须保证外植体能够生存。②尽可能使外植体较快生长发育。最常用的培养基是MS培养基。（二）营养繁殖体的增殖营养繁殖体的增殖是指愈伤组织的增殖。外植体接种到培养基后，经过脱分化作用，形成一团分生细胞（愈伤组织），这团细胞不断分裂使营养繁殖体增殖。2、构建培养基。培养基由营养成分和生长成分构成，前者主要提供38（三）再分化（通过调节激素种类及比例）1、诱导腋芽发生。2、诱导产生不定芽。3、诱导体细胞胚发生。4、诱导根的发生。5、幼苗的驯化锻炼。（四）试管苗移栽大田。主要克服组织失水和病菌感染，保证移栽成活率。（三）再分化（通过调节激素种类及比例）39三、茶树组织与器官培养的概况早在20世纪60年代末，英国剑桥大学化学系开始了茶树幼茎切块培养，用以研究茶树咖啡碱合成途径。此后，各国研究人员也开始了对茶树组织与器官培养的研究，并取得了一些成果。莫典义和黄雁萍（1981）通过种胚培养获得完整植株；中村顺行（1985）培养子胚获得完整植株；刘德华（1990）培养子叶柄获得完整植株；土井芳宪培养茎切段获得完整植株；王毅军（1994）以茶树叶片为外植体，培养出完整的植株。尽管有很多成功的报道，但茶树是多年生木本植物，多酚类含量高，到目前为止，茶树组织和细胞培养技术平台还没有完善，还有很多技术障碍需要克服。三、茶树组织与器官培养的概况40第二节：花粉和花药培养与单倍体育种一、单倍体在植物育种上的作用1、单倍体植物的概念凡具有配子染色体数的植物称为单倍体植物。2、单倍体在植物育种上的作用⑴单倍体染色体加倍可获得纯合二倍体，这对常规杂交育种有极为重要意义。⑵有利于克服远缘杂交的不实性，培育出稳定的远缘杂种新类型。⑶与诱变育种相结合可加速育种进程。⑷作为外源基因转化的受体系统。第二节：花粉和花药培养与单倍体育种一、单倍体在植物育种上的作41二、花粉和花药培养技术（一）花药培养1、取材。关键是选取花粉处于一定发育期的花药。用醋酸洋红染色压片法镜检确定花粉的发育时期，当大多数细胞处在单核中、晚期时，是花药培养取材的最佳时期。2、灭菌。3、建立培养基并接种。在接种时注意彻底除去花丝部分和尽量避免损伤花药。4、脱分化和繁殖增殖。药室内侧分裂形成原胚多细胞团，再经球型胚、心脏型胚、鱼雷型胚等发育阶段，最后以胚状体形式突出于花药壁，再将胚状体细胞转移到另一培养基培养、增殖。二、花粉和花药培养技术425、再分化并形成幼苗。将增殖了的胚状体细胞（愈伤组织）转移到分化培养基上培养，分化出不定芽和根，最后形成单倍体试管苗。6、移栽。通过更换培养基，逐渐降低渗透压和生长素含量，直到幼苗的根、茎、叶生长都较正常和健壮时，移出进行沙培或土培。（二）花粉培养由于在花药培养中所获得的植株不只是来源于花粉，也来源于花药壁、绒毡层等不同部位的体细胞，结果造成所获得植株群体常常是一个既有单倍体，又有二倍体、甚至多倍体的混合群体，给以后的鉴定和利用带来一定困难。花粉培养则可以完全排除花药组织的干扰，使诱导形成的植株全部来源于单倍体的花粉，从而可省略对其鉴定的程序或可以直接利用。但花粉培养所要求的技术要比花药培养5、再分化并形成幼苗。将增殖了的胚状体细胞（愈伤组织）转移到43复杂，许多不明因素有待研究。花粉培养的全过程除了材料的选择和灭菌与花药培养基本相同外，还包括花粉的分离和培养两个步骤。花粉的分离常用自然散落法，培养常用浅层液体培养法。（三）影响花药及花粉培养的因素1、供体植株的基因型。一般地说，性状优良、生活力强的亲本的杂交后代的花药及花粉比较容易诱导形成单倍体植株。复杂，许多不明因素有待研究。442、培养基。培养基不仅影响到外植体能否生存，还影响到其生长速度和能否分化成完整的植株。主要的影响因素有：①营养成分。主要是无机盐和有机成分（如氨基酸、酵母提取液等），为外植体的生长发育提供碳源、氮源、微量元素等。②PH值。一般要求PH值在5。5~7之间。③蔗糖浓度。蔗糖浓度影响到培养基的渗透压。一般地说，开始培养时，蔗糖浓度要高些，以后逐步降低。2、培养基。培养基不仅影响到外植体能否生存，还影响到其生长速45④激素。激素的种类及浓度对花药及花粉的分化起着决定性作用。一般情况下。当生长素与细胞激动素的比值高时，有利长根；比值低时，有利长芽，比值适中时，继续长愈伤组织。3、小孢子发育阶段。只有具一定发育阶段的小孢子，才对外界刺激较为敏感。多数植物以单核期，特别是单核期的中后期比较敏感。4、供体植株的生理状态及培养前的预处理。预处理有低温处理、高温处理、离心处理、减压处理、渗透压处理、碳源饥饿处理、二氧化碳处理等。④激素。激素的种类及浓度对花药及花粉的分化起着决定性作用。一46三、单倍体植株的染色体加倍单倍体植株只有经过染色体加倍，使之成为纯合的二倍体可育植株，才能给育种工作者提供可选择的材料。目前单倍体植株的染色体加倍主要有以下三种途径：1、自然加倍。2、人工诱导加倍。主要用秋水仙碱处理。3、从愈伤组织再生二倍体植株。即利用单倍性细胞的不稳定特性，通过对单倍体植株的茎、叶等组织的再培养，可获得较高比例的加倍植株。三、单倍体植株的染色体加倍47四、单倍体植株及纯合二倍体植株的鉴定。一般是取植株根尖进行细胞学观察，将根尖用卡诺固定液固定，铁矾苏木精染色，制成石蜡切片或者涂片，在光学显微镜下可观察到染色体数目。5、茶树花药及花粉培养的成就。据报道，前苏联、印度、日本和我国的研究人员都对茶树花药及花粉培养进行了研究，最有影响的是陈振光等人（1981）用茶树花药培养，诱导出完整的试管苗和植株。四、单倍体植株及纯合二倍体植株的鉴定。一般是取植株根尖进行细48第三节：细胞培养及其突变体筛选一、单细胞培养单细胞培养是指从植株组织器官或愈伤组织游离出单细胞，在无菌条件下，使其再生完整植株的技术。（一）分离细胞的方法1、物理方法。先将植物组织器官等外植体接种到固体培养基上，让其形成质地松散的愈伤组织，再经过振荡、过滤、离心、沉淀而得到分散的细胞或细胞团。2、酶法（果胶酶和纤维素酶）。第三节：细胞培养及其突变体筛选一、单细胞培养49（二）单细胞培养方法1、液体浅层培养。2、微滴培养。3、平板培养。4、看护培养。5、条件培养。（三）培养细胞的密度及活力的测定1、起始培养的细胞密度。起始培养的细胞密度通常以1万至1亿个/毫升为宜。2、细胞活力的测定。测定方法主要有染色法，（二）单细胞培养方法50包括莹光素双醋酸盐染色法和酚藏花红染色法。3、植板率的测定。植板率的含义是每个平板接种细胞总数形成细胞团的百分率。即：植板率=（每平板形成的细胞团数÷每平板接种的细胞总数）×100%；其中，每平板接种的细胞总数=每毫升培养液中的细胞数目×该平板细胞培养液的毫升数。包括莹光素双醋酸盐染色法和酚藏花红染色法。51二、细胞突变体筛选（一）细胞突变体筛选的意义1、可在小规模的实验室中同时对大量细胞进行选择，节省人力、物力，而且不受环境条件的影响。2、筛选获得的突变体不会出现嵌合体，遗传稳定，易鉴定。（二）细胞突变体筛选的一般技术1、细胞材料的选择。要从再生能力强、染色体数目稳定性好、生长速度快的亲本细胞系中进行选择。另外，如果筛选突变体的目的是为获得能经有性生殖传代的植物，那么就应避免使用非整倍二、细胞突变体筛选52体的细胞作为选择的材料。2、诱发突变的方法①物理方法，如用紫外线、放射线处理。②化学方法，即使用化学诱变剂，如甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）和5-溴去氧尿嘧啶核苷等多种有机物以及一些简单无机化合物．③突变细胞的选择方法Ａ、直接选择。如在培养基中某些重金属离子，若能生存，说明是耐高浓度重金属离子的突变体细胞。Ｂ、间接选择。如在培养基中加入羟基脯氨酸，可选择耐旱性突变细胞。体的细胞作为选择的材料。53（三）突变性状的遗传基础及其稳定性鉴定让细胞或组织在没有选择剂的培养基上继代培养几代，如果仍能表现选择出来的变异性状的，便可基本确定为突变细胞或组织。也可用再生的植株开花结实后所获得的发芽种子或用种子长成的植株为材料，进一步诱导其形成愈伤组织，将这些愈伤组织转移到含有选择剂的培养基上进行培养，如果仍能表现变异性状的，即可认为这些再生植株为变异植株。（三）突变性状的遗传基础及其稳定性鉴定54（四）农业上有用性状的突变体离体筛选１、抗病性筛选。常用活菌选择剂和病菌毒素选择剂进行筛选。２、对除草剂抗性的筛选。３、对温度的抗耐性的筛选。（四）农业上有用性状的突变体离体筛选55第四节：原生质体培养与体细胞杂交一、原生质体和体细胞杂交的概念１、原生质体：植株原生质体是指除去细胞壁由质膜包裹着的具有生活力的植株裸细胞。２、体细胞杂交：指使不同植物的原生质体相互融合形成杂种细胞，再经过人工培养诱导杂种细胞分化形成植株的过程。二、原生质体的分离（一）分离原生质体的材料。常用叶肉组织、无菌苗的子叶以及由植物组织器官形成的愈伤组织及悬浮细胞。第四节：原生质体培养与体细胞杂交一、原生质体和体细胞杂交的概56（二）原生质体的分离１、材料的预处理。目的使游离的原生质体能适应新的培养条件。⑴预培养。⑵暗处理。⑶药物或添加剂处理。⑷萎焉处理。⑸更新培养基。２、原生质体的分离。常用酶法分离。３、原生质体活力的检测：把原生质体放入略微（二）原生质体的分离57降低渗透压的培养基中，那些