实验六 间隔法测定过氧化物酶的活力(原理清晰,步骤清楚)_第1页
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文档简介

一目的掌握间隔法定过氧化物酶活力的原理及操作方法二原理过氧化物酶（peroxidase，POD，EC，催化

HO2

氧化某些酚类、芳香胺和抗坏血酸等还原性物质它广泛分布于生物界在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用如清除细胞内的有害物质素的形成等。

HO保护酶蛋白以及促进植物细胞木质2本实验以愈创木邻甲氧基苯酚

HO2

为底物氧化物酶催化放出新生态氧无色的愈木酚化成红棕色的四邻甲氧基连酚应式如下：过氧化物酶活力的大小在一定范围内与产物颜色的深浅呈线性关系，该产物在460nm有最大的光吸收故可通过测定

A

460

的变化来测定过氧化物酶的活力。这里规定，一个过氧化物酶活力单位为在室温pH5.4的条件下，酶反应体系中每分钟A的增加值为1所需的酶量。460活力测定时，酶反应在分光光度计的比色杯内进行，由于酶反应产物增加而使A460增加，通过定时间隔记录可获得一A值。以时间为横坐标A460

460值为纵坐标进行线性作图（或用统计方法得回归方程），进而计算A460的变化速率（D

A

·min），最后计算每克鲜重样品中过氧化物酶活力的大小。460

三实验材料设备1.材料禾本科植物叶片2.仪器电子天平

高速冷冻离心机

分光光度计

冰浴3.器材刻度试管：10mL×1移液管：5mL×1微量进样器：1000ml烧

杯：250mL×250mL×1离心管：7mL×1（带盖）滴

管：2洗耳球：2硫酸纸研钵、剪刀、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各四试剂的配1.酶提取缓冲液50mmol/L、pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，内5mmol/L亚硫酸氢钠和1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)（临用前加）。2.酶活力测定缓冲液0.1mol/L、pH5.4醋酸-醋酸钠缓冲液3.愈创木液（0.25%W/V（溶于50%乙醇中）（临用前配制）4.

H

溶液（0.75%）（临用前配制）五操作步骤1.酶液的制备(1)取材：称取左右叶片，记下实际质量g。(2)研磨：将样品剪碎于研钵中，加入预冷的酶提取缓冲液，置冰浴上充分研磨。(3)离心浆液全部转入塑料离心管℃下10,000g离15min。上清液全部倒入试管，此上清液即为粗酶液，待测。2.酶活力测定(1)将分光光度计预热，波长定于460nm处。(2)在玻璃比色杯内，先加入醋酸-醋酸钠缓冲液和1mL0.25%创

--木酚溶液，0.1mL0.75%HO

再加入或0.1mL酶（视酶活力大小而定最后加入溶液，用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀。(3)立即把比色杯插入比色架，关盖。迅速把A调至0并开始记时，460每隔30秒读取并记录

A

460

值，共读3分钟。（注：酶液加入量一般控制5min内使

A

460

达到0.5～0.8宜）六结果处理1.以时间为横坐标，A统计方法求回归方程）；

460

值为纵坐标，对所得数据进行线性作图（或用2.求出上图中所作直线（或回归方程）的斜率，即A·min-1，此460为反应的初速度；3.求出每克鲜重植物样品中过氧化物酶的活力

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