色谱法的理论与实践课件

色谱法的理论与实践11/23/20221色谱法的理论与实践11/22/20221一、色谱基础理论概述色谱法或称层析法（chromatography）是一种物理或物理化学的分离分析方法。1906年俄国植物学家TswettM将碳酸钙装在竖立的玻璃柱内，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗，在柱的不同部位形成色带，因而命名为色谱法。11/23/20222一、色谱基础理论概述色谱法或称层析法（chromatogra色谱法是利用物质在不同的两相中分配、吸附或其他亲和作用的差异，通过多次重复使微小的差别积累起来变成大的差异，从而使混合物中各组分达到分离。色谱技术在近二十多年中的飞速发展已形成一门专门的科学，称为色谱学。广泛应用于各个领域，成为多组分混合物的最重要的分离分析方法。11/23/20223色谱法是利用物质在不同的两相中分配、吸附或其他亲和作用的差异二、色谱法的分类

按流动相与固定相的分子聚集状态分类按流动相的分子聚集状态分类GC，LC，超临界流体色谱（SFC）按固定相的聚集状态分类气相色谱法（气-固，气-液）液相色谱法（液-固，液-液）按操作形式分类柱色谱，平面色谱，逆流分配11/23/20224二、色谱法的分类按按色谱过程的分离机制分类

吸附色谱（adsorption~）利用吸附能力的差别.分配色谱（partition~）利用分配系数的差别.空间（分子）排阻色谱（stericexclusion~）或称凝胶色谱法（gel~）利用被测物分子大小不同而导致的渗透系数差异.11/23/20225按色谱过程的分离机制分类吸附色谱（adsorption~离子交换色谱（ionexchange~）利用在离子交换树脂上的交换能力差别。又可分为:氨基酸分析（aminoacidanalysis）离子色谱法（ionchromatography）亲合色谱（affinity~）将生物活性配位基（酶、辅酶，抗体等）键合到载体表面形成固定相，利用亲合力大小进行分离(专用于蛋白质等生化样品）。11/23/20226离子交换色谱（ionexchange~）11/22/20毛细管电色谱（capillaryelectro-~）依靠色谱与电场两种作用力，利用分配系数和电泳速度差别而分离。毛细管电泳（capillaryelectrophoresis）以高压电场为驱动力，根据样品组分的淌度和分配系数而分离。手性色谱（chiralchromatography）利用手性识别原理，用于手性药物的分离分析。11/23/20227毛细管电色谱（capillaryelectro-~）11填充柱毛细管柱毛细管电色谱毛细管电泳柱色谱平面色谱逆流分配色谱GC

LCSFCCEC色谱法经典液相色谱HPLC纸色谱法薄层色谱法薄膜色谱法11/23/20228填充柱毛细管电色谱柱色谱GC色谱法经典液相色谱纸色谱法11/热力学理论——塔片理论是由平衡的观点来研究分离过程，是一种半经验理论，以塔片理论为代表。动力学理论——速率理论是从动力学观点，即速度来研究各种动力学因素对柱效的影响，以VanDeemeter方程式为代表。三、色谱理论

11/23/20229热力学理论——塔片理论三、色谱理论11/22/20基本概念色谱峰（peak）——样品产生的电信号强度对洗脱时间作图。称为流出曲线，浓度-时间曲线，也称色谱带（band）。色谱峰有三种形式：对称峰拖尾峰（tailingpeak）前延峰（leadingpeak）11/23/202210基本概念11/22/202210峰形参数：对称因子（symmetryfactor，fs）fs=(A+B)/2A；或用：拖尾因子（tailingfactor，T）来衡量T=W0.05h/2d1T=0.95～1.05(正常峰)T＜0.95(前延峰)T﹥1.05(拖尾峰)掌握11/23/202211峰形参数：掌握11/22/202211T=W0.05h/2d1，或fs=(A+B)/2AW0.05h=x=h/20峰的对称性hABd1xW0.05h11/23/202212W0.05h=x=h/20峰的对称性hA一个色谱峰，可用三项参数来描述：峰高或峰面积——定量峰位（保留值）——定性峰宽——衡量柱效峰面积(A)峰高(h)tRtR掌握11/23/202213一个色谱峰，可用三项参数来描述：峰面积(A)峰高(h)t基线（baseline）——在操作条件下，检测器中只有流动相通过时的流出曲线称为基线。它反映了仪器的噪音随时间的变化。噪音（noise，N）——各种未知的偶然因素引起的基线起伏的现象称为噪音。噪音的大小用噪音带的宽度来描述。Nmv基线漂移掌握11/23/202214基线（baseline）——在操作条件下，检测器中只有流定性参数保留值保留时间，保留体积相对保留值保留指数11/23/202215定性参数11/22/202215保留值保留时间（retentiontime，tR）——进样开始到组分色谱峰顶点时间间隔。死时间（deadtime，t0或tM）——流动相通过色谱系统的时间。11/23/202216保留值11/22/202216调整保留时间（adjustedretentiontime，t’R）也称为表观保留时间、校正保留时间——某组分由于溶解或被吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的组分在柱中多停留的时间，即：t’R=tR－t0，在实验条件一定（温度、固定相），t’R决定组分的性质，故t’R是定性的基本参数。11/23/202217调整保留时间（adjustedretentiontimet’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime进样11/23/202218t’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime进保留体积（retentionvolume，VR），又称洗脱体积——流动相携带样品进入色谱柱，由进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时，通过色谱柱的流动相体积。

11/23/202219保留体积（retentionvolume，VR），又称相对保留值（1,2)——指组分（1）与参照物（2）两者调整保留值的比值。1,2=t’R（1）/

t’R（2）

=K1/K2(K为分配系数）保留指数（I，Kovats指数）——是把组分的保留行为换算成相当于含有几个碳的正构烷烃的保留行为来描述。11/23/202220相对保留值（1,2)保留指数（I，Kovats指数）11/柱效率的参数（色谱峰的区域宽度）标准差（，standarddeviation)半峰宽（peakwidthathalf-height，W1/2或Y1/2）基线宽度（peakwidth，W或Y）熟悉11/23/202221柱效率的参数（色谱峰的区域宽度）熟悉11/22/202221标准差——在正态分布曲线中，将x=±1处（拐点）的峰宽之半称为标准偏差。在实际工作中,标准差为峰高0.607h处的峰宽之半。峰形窄，小，分散度小，柱效高。反之，柱效低。h0.607hxx=0时，曲线的高度为峰高h11/23/202222标准差——在正态分布曲线中，将x=±1处（拐点）的峰宽之半称半峰宽——也称半腰宽，为色谱峰高之半处的峰宽。W1/2=2.355，W1/2易确定，且比值大，故测量误差较小。h0.5hW1/211/23/202223半峰宽——也称半腰宽，为色谱峰高之半处的峰宽。W1/2=2.峰宽——也称基线宽度。对色谱峰两侧的拐点作切线,在极限上所截的距离,称为峰宽。对色谱峰两侧作切线后为等腰三角形，底边为峰宽，而为等腰三角形高度之半处的宽度之半，所以：W=4W11/23/202224峰宽——也称基线宽度。对色谱峰两侧的拐点作切线,在极限上所截

Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2.355，W=4=1.699W1/211/23/202225Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2分配系数（partitioncoefficient，K）

在一定条件下，达到分配平衡后：样品组分在固定相中的浓度（Cs）样品组分在流动相中的浓度（Cm）K=Cs/Cm

=K11/23/202226分配系数（partitioncoefficient，K）分离参数分离参数用于衡量分离条件的优劣，常用分离度，表示。分离度（resolution，R）R=即相邻两峰分开的距离是平均峰宽[(W1+W2)/2]的几倍。R大,分离效果好。2（tR2-tR1）W1+W211/23/202227分离参数2（tR2-tR1）W1+W211/22/20R=0.5tR2-tR1=2，称为2分离。分离后各峰露出的面积≥68.3%R=1.0称为4（峰顶间距为4），两峰峰基略有重叠，裸露峰面积≥95.4%R=1.5tR2-tR1=6，称为6分离（峰顶间距为6），分离后各峰露出的面积≥99.7%R﹥1.5R﹥1.5，称为完全分离11/23/202228R=0.5tR2-tR1=2，称为2分离。分离后各峰露出塔板理论把色谱柱看作一个分馏塔，在每个塔板的间隔内，样品混合物在气液两相中达到分配平衡，经多次分配平衡后，分配系数小的组分，先到达塔顶（先流出色谱柱）。由于色谱柱的塔板相当多，因此分配系数的微小差别就可获得很好的分离效果。在柱内一小段长度H内（相当于一个分馏塔），组分可以很快在两相间达到平衡，H称为理论塔板高度。11/23/202229塔板理论11/22/202229理论板数（n）与理论板高度（H）

n=（tR/）2n=5.54（tR/w1/2）2n=16(tR/w)2n越大，柱效越高。如果用t’R计算理论板数，所得值为有效理论板数n有效11/23/202230理论板数（n）与理论板高度（H）11/22/202230理论板数取决于：固定相种类、性质、填充状况、柱长；流动相及其流速；被测物性质等。理论板高(H)H=L/nL为色谱柱长度，当L一定时，H与n呈反比，即H越小，柱效越高。11/23/202231理论板数取决于：11/22/202231速率理论速率理论是把色谱过程看作一个动态过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽的影响。气相色谱——VanDeemeter方程式HPLC速率方程式——Giddings方程式11/23/202232速率理论11/22/202232重点：1.色谱理论2.色谱分类方法3.主要术语概念：11/23/202233重点：11/22/202233色谱法的理论与实践11/23/202234色谱法的理论与实践11/22/20221一、色谱基础理论概述色谱法或称层析法（chromatography）是一种物理或物理化学的分离分析方法。1906年俄国植物学家TswettM将碳酸钙装在竖立的玻璃柱内，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗，在柱的不同部位形成色带，因而命名为色谱法。11/23/202235一、色谱基础理论概述色谱法或称层析法（chromatogra色谱法是利用物质在不同的两相中分配、吸附或其他亲和作用的差异，通过多次重复使微小的差别积累起来变成大的差异，从而使混合物中各组分达到分离。色谱技术在近二十多年中的飞速发展已形成一门专门的科学，称为色谱学。广泛应用于各个领域，成为多组分混合物的最重要的分离分析方法。11/23/202236色谱法是利用物质在不同的两相中分配、吸附或其他亲和作用的差异二、色谱法的分类

按流动相与固定相的分子聚集状态分类按流动相的分子聚集状态分类GC，LC，超临界流体色谱（SFC）按固定相的聚集状态分类气相色谱法（气-固，气-液）液相色谱法（液-固，液-液）按操作形式分类柱色谱，平面色谱，逆流分配11/23/202237二、色谱法的分类按按色谱过程的分离机制分类

吸附色谱（adsorption~）利用吸附能力的差别.分配色谱（partition~）利用分配系数的差别.空间（分子）排阻色谱（stericexclusion~）或称凝胶色谱法（gel~）利用被测物分子大小不同而导致的渗透系数差异.11/23/202238按色谱过程的分离机制分类吸附色谱（adsorption~离子交换色谱（ionexchange~）利用在离子交换树脂上的交换能力差别。又可分为:氨基酸分析（aminoacidanalysis）离子色谱法（ionchromatography）亲合色谱（affinity~）将生物活性配位基（酶、辅酶，抗体等）键合到载体表面形成固定相，利用亲合力大小进行分离(专用于蛋白质等生化样品）。11/23/202239离子交换色谱（ionexchange~）11/22/20毛细管电色谱（capillaryelectro-~）依靠色谱与电场两种作用力，利用分配系数和电泳速度差别而分离。毛细管电泳（capillaryelectrophoresis）以高压电场为驱动力，根据样品组分的淌度和分配系数而分离。手性色谱（chiralchromatography）利用手性识别原理，用于手性药物的分离分析。11/23/202240毛细管电色谱（capillaryelectro-~）11填充柱毛细管柱毛细管电色谱毛细管电泳柱色谱平面色谱逆流分配色谱GC

LCSFCCEC色谱法经典液相色谱HPLC纸色谱法薄层色谱法薄膜色谱法11/23/202241填充柱毛细管电色谱柱色谱GC色谱法经典液相色谱纸色谱法11/热力学理论——塔片理论是由平衡的观点来研究分离过程，是一种半经验理论，以塔片理论为代表。动力学理论——速率理论是从动力学观点，即速度来研究各种动力学因素对柱效的影响，以VanDeemeter方程式为代表。三、色谱理论

11/23/202242热力学理论——塔片理论三、色谱理论11/22/20基本概念色谱峰（peak）——样品产生的电信号强度对洗脱时间作图。称为流出曲线，浓度-时间曲线，也称色谱带（band）。色谱峰有三种形式：对称峰拖尾峰（tailingpeak）前延峰（leadingpeak）11/23/202243基本概念11/22/202210峰形参数：对称因子（symmetryfactor，fs）fs=(A+B)/2A；或用：拖尾因子（tailingfactor，T）来衡量T=W0.05h/2d1T=0.95～1.05(正常峰)T＜0.95(前延峰)T﹥1.05(拖尾峰)掌握11/23/202244峰形参数：掌握11/22/202211T=W0.05h/2d1，或fs=(A+B)/2AW0.05h=x=h/20峰的对称性hABd1xW0.05h11/23/202245W0.05h=x=h/20峰的对称性hA一个色谱峰，可用三项参数来描述：峰高或峰面积——定量峰位（保留值）——定性峰宽——衡量柱效峰面积(A)峰高(h)tRtR掌握11/23/202246一个色谱峰，可用三项参数来描述：峰面积(A)峰高(h)t基线（baseline）——在操作条件下，检测器中只有流动相通过时的流出曲线称为基线。它反映了仪器的噪音随时间的变化。噪音（noise，N）——各种未知的偶然因素引起的基线起伏的现象称为噪音。噪音的大小用噪音带的宽度来描述。Nmv基线漂移掌握11/23/202247基线（baseline）——在操作条件下，检测器中只有流定性参数保留值保留时间，保留体积相对保留值保留指数11/23/202248定性参数11/22/202215保留值保留时间（retentiontime，tR）——进样开始到组分色谱峰顶点时间间隔。死时间（deadtime，t0或tM）——流动相通过色谱系统的时间。11/23/202249保留值11/22/202216调整保留时间（adjustedretentiontime，t’R）也称为表观保留时间、校正保留时间——某组分由于溶解或被吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的组分在柱中多停留的时间，即：t’R=tR－t0，在实验条件一定（温度、固定相），t’R决定组分的性质，故t’R是定性的基本参数。11/23/202250调整保留时间（adjustedretentiontimet’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime进样11/23/202251t’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime进保留体积（retentionvolume，VR），又称洗脱体积——流动相携带样品进入色谱柱，由进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时，通过色谱柱的流动相体积。

11/23/202252保留体积（retentionvolume，VR），又称相对保留值（1,2)——指组分（1）与参照物（2）两者调整保留值的比值。1,2=t’R（1）/

t’R（2）

=K1/K2(K为分配系数）保留指数（I，Kovats指数）——是把组分的保留行为换算成相当于含有几个碳的正构烷烃的保留行为来描述。11/23/202253相对保留值（1,2)保留指数（I，Kovats指数）11/柱效率的参数（色谱峰的区域宽度）标准差（，standarddeviation)半峰宽（peakwidthathalf-height，W1/2或Y1/2）基线宽度（peakwidth，W或Y）熟悉11/23/202254柱效率的参数（色谱峰的区域宽度）熟悉11/22/202221标准差——在正态分布曲线中，将x=±1处（拐点）的峰宽之半称为标准偏差。在实际工作中,标准差为峰高0.607h处的峰宽之半。峰形窄，小，分散度小，柱效高。反之，柱效低。h0.607hxx=0时，曲线的高度为峰高h11/23/202255标准差——在正态分布曲线中，将x=±1处（拐点）的峰宽之半称半峰宽——也称半腰宽，为色谱峰高之半处的峰宽。W1/2=2.355，W1/2易确定，且比值大，故测量误差较小。h0.5hW1/211/23/202256半峰宽——也称半腰宽，为色谱峰高之半处的峰宽。W1/2=2.峰宽——也称基线宽度。对色谱峰两侧的拐点作切线,在极限上所截的距离,称为峰宽。对色谱峰两侧作切线后为等腰三角形，底边为峰宽，而为等腰三角形高度之半处的宽度之半，所以：W=4W11/23/202257峰宽——也称基线宽度。对色谱峰两侧的拐点作切线,在极限上所截

Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2.355，W=4=1.699W1/211/23/202258Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2分配系数（partitioncoefficient，K）

在一定条件下，达到分配平衡后：样品组分在固定相中的浓度（Cs）样品组分在流动相中的浓度（Cm）K=Cs/Cm

=K11/23/202259分配系数（partitioncoefficient，K）分离参数分离参数用于衡量分离条件的优劣，常用分离度，