【doc】血清甘油三酯测定的推荐方法-二步酶法：（讨论稿）

血清甘油三酯测定的推荐方法——二步酶法：（讨论稿）38?5.4血标本应在静置的试管中自行凝固,室温约45rain.血清或血浆应在3小时内离心与血细胞分离,吸出后保存.5.5血清或血浆可在4℃密闭保存.一周内TC稳定.一20U至少可存放半年6操作步骤6.1终点法测定标本(血清或血浆)l0l,标准液【Ol,酶试剂1.00ml}设试;}lf空白管}温度与时间:37'C5min,或20一25℃l0min}比色波长:500nm(或520nm).颜色稳定至少60rain.故在达终点后60min内比色.结果计算:"rCrnmot/L=韭×定标血清浓度(retool~L)6.2速率法根据不同仪器及试剂(需增加酶用量)制定测定条件.7方法特性7.1精密度终点法批内CV<』.5.批间CV≤2.57.2准确性以参考方法(ALBK法)的血清为标准液时,本法测定结果与ALBK法基本一致.以Chol水溶液为标准时,结果往往比ALBK法低.故不宜采用Chol水溶液7.3灵敏度显色剂用酚时,TC5.2retool/L(200mg/d1)时的吸光度A约0.30～0.35,故A;0=0.005时的TC浓度约0.08mmol/L(3mg/d1).牡库鞋验信息导撮】994年革1毒革2期7.4测定范围血清与酶试剂用量之比为l:100时(见6.1],测定上界为】3mmol/L(500mg/d1).过高地提高血清用量的比例.会使测定上界降低.7.5特异性血清中多种非胆固醇甾醇会不同程度地与本试剂显色正常人血清中非胆固醇甾醇约占TC的1,故在常规测定中这种影响可以不计.7.B干扰因素终点法中血红蛋白高于2g/L会引起正干扰,胆红素>0.1g/L时有明显负干扰.抗坏血酸与甲基多巴血中浓度高于治疗水平时也使结果偏低.上述干扰物在速率法中影响较小.高甘油三酯血症(血清混浊)在本法中(血清与试剂量l:J00时)一般会明显影响.8参考值TC水平因生活条件(饮食,运动等)而异,随年龄上升.中青年男性略高于女性(北京城区居民平均在4.1～4.7mmol/L.160—180rag/d1).老年女性高于男性(男性平均d.9～5.2retool/L,i90—200mg/dl,女性平均5.4retool/L2】0rag/dl左右).中,老年人合适水平为5.2retool/L以下,5.2--6.5retool/L为临界水平(或轻度升高).≥6.5mmol/L(250mg/dI)为高胆固醇血症.≥7.8retool/L(300reIg/d1)可视为严重的高胆固醇血症.9参考文献(略)(李健斋执笔)《血液流变学基础及临床检测》征订启事由江西科学技术出版社出版.南京市建邶医院戴荣锦主任编着的《血{谩流变学基础及临床检测》一书将于95年初发行全书共28万余字,内容涉及流体力学概念,血液流变学基础理论,国内流行的血液流变学仪器和检测方法.全书理论联系实际,是血液流变学检测工作者的工具书.初,中级检验人员自学资料.中等检验专业学校的补充教材,也是参与血液流变学实践的基层临床医务工作者的参考书.欢迎订阅.请直接与作者联系(邮编210004).临庠栓驻信息导报199]牛幕-毒苇2期,?39?忸血看断,廿.;抽湾④～血清甘油三酯测定的推荐方法——二步酶法.,(讨论稿)堑墨垦兰三兰V许叶吕邦泰(宁波市临床检验中心,淅江宁波3I5.0.)牛,//[缩写名词]To甘油三酯FG游离甘油LpL脂蛋白酯酵GK甘油檄酶GPO甘油磷酸氧化酶POD辣根过氧化物酶ATP三磷酸腺苷ADP二磷酸腺苷4--CP4一氰酚4一AAP4一氪基安替比林PAPPOD,4--AAP,4一cP三者的简称AKP碱性磷酸酶1引言酶法测定TG方法很多,其中GPO—PAP法比其它方法具有更多的优越性而被推荐.综观其优点:具有方法简便,易于自动化I线性范围宽以及灵敏,精密和相对特异等,适合常规测定,但由于不经抽提,血清中存在的多种物质会引起干扰,其中FG的干扰最引人注目,能引起血浆中FG增高的原因很多,诸如某些疾病,代谢紊乱,紧张,静脉营养,接受含甘油的药物治疗以及注射肝素后均可增高.目前,排除FG干扰的方法有二种,一是用不含脂酶的TG试剂作一FG空白减去(称外空白法)此法可同时测定FG值,但试剂成本和工作量均增加一倍.且脂血标本会产生负干扰,除非用不含脂酶和GK的酶试剂作标本空反应过程如下:白,但又增加工作量和费用,另一有效的方法是试剂分二步加入的预孵育法(称内空白法),此法不增加费用,手工操作多加一步试剂,井能输入绝大部分牌号的自动分析仪,操作简便,由于此法排除了酶法测定TG的主要干扰,且精密度和准确性均较好,为了配合脂类测定标准化工作的开展,本学会推荐此法作为TG测定的常规方法,对方法的细节规定如下.2原理将GPO—PAP法的试剂分成二部分,其中LPL(或/和脂酶)和双色原中的d--AAP组成试剂Ⅱ,其余部分成为试剂1,血清加试剂1,37℃孵育,因无LPL,TG不能水解,FG在GK和GPO作用下反应,生成HO.但因体系中不含d—AAP,Trinder反应不能完成.甘油——_=;==_.一磷酸甘油—_竺I:—磷酸二羟丙酮ATPADPH0+02H,0+0P0D然后加入试剂Ⅱ(LPL和4AAP),TG反应,最后生成红色苯醌亚胺,见下式TG+3H2OILPL+甘油+3FA0K3一磷酸甘油磷酸二羟丙酮AT/PA,DP2H2(02022H2O"{-Hc,一/,d—CP+4一AAP苯醌亚胺d0苯醌亚胺吸收峰波长为500nm,由于吸收峰较平坦,波长在480—520nm范围内均可测定.3仪器3.1手工操作光度计,分光光度计(普及型)和半自动分析仪均适用,微量加样器,吸管以及稀释仪均应校准3.2自动分析能完成二步反应程序的自动分析仪均适用.4试剂4.1原料试剂的纯度要求脂酶(EC3.1.1.3)来源于酒曲菌属或假单胞菌属,杂酶中ATP酶应≤0.001%,无葡萄糖氧化酶和尿酸酶}比活性≥2400U/mg冻干物(25"C,橄榄油)LPL(EC3.t.1.34)来源于假单胞菌属.杂酶中葡萄糖氧化酶≤0.001-尿酸酶≤0.05%,ATP酶40.00.5.比活性100U/mg冻干物(25'C.胆固醇油酸盐).GK(EC2.7.1.30)来源于芽胞杆菌属或念珠菌属,杂酶中测不出氧化酶,古甘油应<5.g/l00U,比活性≥5U/mg冻干物(25"C,甘油,ATP),芽胞杆属GK的三级结构和热稳定性均比念珠菌属GK要好.GPO(EC1.1.3.一)来源于小球菌属或纤维单胞菌属.杂酶中乳酸氧化酶≤0.002,尿酸酶≤0.001,不古过氧化氢酶,比活性≥60U/rag冻干物(37℃,L—a一磷酸甘油)POD(EC1.11.1.7)来源于辣根.杂酶中过氧化氢酶≤0.7,ATP酶0.001.纯度值(Ad03nm/A2)≥3.0,比活性≥250U/ms冻干物.(25℃,愈刨木酚,H2Oz).ATP含量≥98Tritonx一100不含过氧化物.Tris,一cP.4--AAP和胆酸钠等均为分析纯试剂.4.2试剂配制Tris—HC]缓冲液:0.15mol/L,pH7.6,4--CP2.5retool/L,硫酸镁10retool/L.胆酸钠3.5retool/L,Tritonx一1000.1g/L.ATPi.0mmol/I..临库检验信息导植1994牛第1春第2期酶溶液I:GK500U,GPO3000U,POD1000U,溶于50mlTris—Hcl缓冲液中.酶溶液Ⅱ:脂酶或LPL30000U,4一AAPlmmol溶于50mlTrist—Hcl缓冲液中.4.3应用试剂配制4.3.1手工操作用应用试剂I:酶溶液I5ml加Trjs—HCd5ml混匀.应用试剂I:酶溶液Ⅱ5ml加Tris--HCI45ml混匀.4.3.2自动分析用应根据各分析仪试剂I和I的用量调整缓冲液与酶的比例(但缓冲液与酶I和酶I的最终比例9t0.5t0.5不变).一般分析仪试剂I和I的用量为3:I,但Monarchl000或2000,试剂I最多只能加8Ol,而试剂I可以多加,试剂I和I的用量以l,3较合适,分析仪应用试剂的配制见下表.附表分析仪应用试剂的配翩应用试剂配制比例析蓑兰一l00o程序特殊的分析仪可根据上述原则配制应用试剂.4.dTG测定参考物人血清中的TG,含有不同链长的脂肪酸和不同数量的不饱和键,以及TG的疏水性并被包裹在脂蛋白颗粒核心,因此要制备与血清中TG完全相同的一级标准似乎是不可能的.TG反应的终产物是甘油.故常用甘油作参考物,但甘油本身不是分析物.不参加反应的全过程,只能认为是一种指示反应的参考物,且不能作为二步酶法的参考物.三油酸甘油酯.虽然不能完全代表血清中TG的脂肪酸组成,但与血清中TG的脂肪酸平均链长相似,可用高纯度的产品配成水溶液作TG测定的参考物.2mmol/L三油酸甘油酯水溶液的配制精密称取三油酸甘油酯l77mg(可直接称入l00ml容量瓶中),加Tritonx一1005ml,摇动,使成乳浊状,置56℃水溶约l0分钟.澄清临庳挂驻信息导掖1994年苹1卷羊2期后加蒸馏水90ml,冷却至室温,再加蒸馏水至刻度线,2ml安培分装置4℃至少稳定二年,注意:切勿冰冻,冰冻后溶液变混(加热后会澄清),久冻后值会降低.5标本采集,处理和贮存5.1受检者在抽血前一周应保持平时的饮食习惯,停用影响血脂的药物(如降脂药和避孕药等),禁食12小时后清晨空腹取坐位(除卧床不起者外)至步5分钟后来血,用止血带时间不超过一分钟,静脉穿刺成功后立即松开止血带抽血.5.2血标本静置室温自行凝固,及时分离血清,取出备甩,血凝固后如不及时分离血清,红细胞中的磷酸酶会选出,水解血清中的甘油酯,干扰测定.EDTA或肝素抗凝血浆亦可用作测定,注意在分离浆时要有足够的离心力和离心时间使血小板完全沉淀,否则测定体系中的表面活性剂能使务血小板破碎,释放出AKP干扰测定,用血浆测定结果比血清低3.5.3如不能及时测定,血清或血浆应贮于密闭的窖器内,置4℃一周内TG稳定,--20℃数月内稳定.B操作步骤6.1手工操作分别加10gl标本,标准溶液和蒸馏水于测定管,标准管和空白管中,各管均加0.5ml试剂I,混匀,37℃水浴5分钟}然后各管再加入0.5ml试剂I,混匀后37℃水浴10分钟,波长500rim,空白管校零,读取标准管与测定管A值,按下式计算结果:器善号×标准管含量;TOmmot/6.2自动分析参数波长:50Onm,反应温度:37℃,标准:2.0mmol/L,空白:试剂,标本:3pl}试剂I:240l,反应时间:d分钟试剂I:80gl,反应时间j8分钟.注:1.如用双波长,次波长为620nm2.如标本增加,试剂I和I亦相应增加,标本试剂比以ll00左右为宜.3.按本法配制的试剂6分钟到达终点,某些仪器反应时间限制得较短,如Techni—con为9分钟,Ciba--Corning为10分钟,第一步反应4分钟,第二步反应只能5或6分钟,但对测定结果影响不大.d.Monarch程序中第二试剂先和标本混合反应,试剂I应放在第二试剂的位置,试剂I则放在第一试剂位置.7本法的技术指示7.1排除Ft3能力预孵育4分钟能完全排除2mmol/L的FG7.2试剂空白吸光度A500rim≤0.05.7.a反应到达终点时间指TG反应,不包括预孵育37℃≤8分钟.7.4显色后的稳定性≥30分钟.7.5灵敏度2mmol/L(177mg/d1)的TG,A50Onm应>/0.2.7.6特异性脂酶或LPL除能水解TG外还能水解甘油一酯和甘油二醋(血清中二者约占TG的3),亦被计算在TG中,实际上测定的是总甘油酯.7.7线性范围11.3mmol/L(1O00mg/d1).7.8精密度批内CV≤3.0'批间CV≤5.0.7.9准确度本法结果和VanHandeI法及减FG空白的GPO—PAP法一致.7.10干扰本法显色(Trinder)反应中存在干扰,干扰因素与胆固酵测定类同.胆红素≥100vmol/L或抗坏血酸≥170pmol/L时出现负干扰,血红蛋白的干扰是复杂的,它本身的红色会引起正干扰,溶血后,红细胞中的磷酸酶可水解磷酸甘油产生负干扰,当Hb~Ig/L时反映为负干扰I≥1g/L时出正干扰,但Hb≤2g/L时干扰不显着,明显溶血标本不宜作TG测定.5种常用抗凝剂在规定的抗凝浓度内不影响结果.34种常用药物(不包括降脂药,避孕药或注射肝素)在治疗浓度时不影响测定结果.脂血标本(TG浓度在本法线性范围内)无明显干扰.8对试剂盒的质量要求a.1技术指标试剂盒的各项技术指标均应达到上述水准.8.2稳定性未开封的试剂至少在6个月内稳定(上述指标不变),这就需要加入稳定剂,并要求加入的稳定剂对反应无干扰,应用试剂贮4℃至少稳定三天,此期间不应出现可见的红色,技术指标不应降低.8.3橙明度液态试剂配成应用液后,以及冻干,干粉或片剂复溶后应无微细的颗粒和肉眼眼可见的红色,A500nm≤0.05.8.4试剂盒应标明出厂日期及有效期,说明书应列出试剂配方和技术指标.9参考值TG水平与种族,年龄,性别以及生活习惯(如饮食,运动等)有关.我国人的TG水平显着低于欧美白人,国内李健斋等根据北京市人群的调查提出成年人的合适TG水平<2.26mmo[/L(<200mg/d1)I>11.3mmol/L(1000mg/d[)为严重的高TG血症.临康世齄信息导报1994牛苇l毫蓦2期lo参考文献(略)附注:鉴于目前TG测定的二步酶法试剂盒只有十别厂家生产,使用该法的实验室亦只局限在少数地区t因此,现阶段在推荐二步酵法的同时允许一步酵法并存,然后逐步过渡到统一采用去FG的二步酶法,但一步酵法亦应按照标准化的要求,即除配成单一试荆(试剂中ATP可低至05mmol/L)和一步反应外,其它要求例如原料试剂的纯度要求,参考物.标本的采集,处理和贮存,方法的技术指标(不包括排除FG的能力)以及对试剂的质量要求均同二步酶法.要求生产TG测定试剂盘的厂家尽快发展二步酶法试剂盘的生产.并要求研究实验室和参加脂类测定标准化的实验室率先采用去FG的二步酶法.其它实验室应创造条件逐步统一采用二步酵法.在未统一方法前,实验室报告TG测定结果时应注明"去FG的值或.未去FG的值.这将有助于临床医生对结果的正确解释.丽珠试剂厂申检试剂全部合格7月22日,由卫生部中国药品生物制品检定所主持的生物制品"贴签"在珠海丽珠集团丽球试剂厂进行.在检定所,市药政部门的专家监督下,贴有"