第十三章-免疫细胞分离与功能检测幻灯片

第十三章

免疫细胞分离与功能检测及应用

何印习内容1淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类2抗原提呈细胞表面标志的检测3免疫细胞的分离其他免疫细胞功能检测技术5免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用6淋巴细胞功能检测4目的要求

掌握：Ficoll-hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测；熟悉：T细胞功能的体内试验，T细胞介导的细胞毒检测的方法；了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。第一节免疫细胞的分离免疫细胞的分离及检测※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定※方法：体外法为主※目的：判断机体免疫状态※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效免疫细胞的分离是指将各种参与免疫反应的细胞从血液或组织中分离出来5免疫细胞种类免疫细胞的分离流程外周血PBMC纯淋巴细胞T、B细胞TC亚群/BC亚群PBMC包括：淋巴细胞、单核细胞各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离常用分层液：ficoll－hypaque，percoll一、外周血单个核细胞的分离和纯化细胞比重血小板1.030~1.035PBMC1.075~1.090多核白细胞1.092红细胞1.093外周血各细胞成分的密度

Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。Ficoll分层液：密度1.077±0.001离心：密度梯度离心分离：各类细胞按其相应密度重新分布

一、Ficoll分离法Ficoll分层液分离单个核细胞示意图二、淋巴细胞的分离

纯淋巴细胞群的采集原理：利用单核细胞在37℃和Ca离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞中除去单核细胞的方法，以获得高纯度的淋巴细胞群。(一)粘附贴壁法因B细胞也有贴壁现象，因此，本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。(二)吸附柱过滤法

将单核细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下来的主要是淋巴细胞(三)磁铁吸引法利用单核细胞具有吞噬的特性，在悬液中加入羰基铁颗粒，待单核细胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞群。78％98％（四）Percoll分离法返回章目录三、T、B细胞和T细胞亚群的分离免疫磁珠分离法流式细胞术分离法其他方法（一）免疫磁珠分离法

488nm激光+-前向散射光检测器

荧光检测器电磁场单个细胞被分类进入检测管流式细胞术分离原理示意图第二节淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类一、T细胞表面标志及亚群CD4+TCD8+TCD3+CD4+CD8-CD3+CD4-CD8+主要为Th（helpTcell）辅助性T细胞主要为Tc（cytotoxicTcell）细胞毒性T细胞二、B细胞表面标志及亚群亚群NK细胞典型标志：CD56和CD16三、NK细胞表面标志第三节抗原提呈细胞表面标志抗原提呈细胞（APC）：是指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原信息提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞。单核-巨噬细胞树突状细胞（1）分泌TNF-α、NO、反应氧中间产物及蛋白水解酶等（2）ADCC效应（3）激活T细胞产生细胞因子等活化巨噬细胞协同杀伤肿瘤细胞。（一）单核吞噬细胞（CD14）1.吞噬和杀伤作用2.杀伤肿瘤细胞形态呈树突样具有一些相对特征性表面标志抗原提呈能力强能激活初始T细胞免疫应答的始动者二、树突状细胞（dendriticcells，DC）特征：1.起源于造血干细胞由髓样干细胞（多数）、淋巴干细胞分化。2.表面标志丰富如：MHCⅡ类分子及Ⅰ类分子、B7-1和B7-2、CD40、CD1以及粘附分子等。3.分泌多种细胞因子

IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-α等。DC主要标志：CD1a、CD11c、CD83第四节T细胞功能检测一、T细胞功能检测淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松（一）T淋巴细胞增殖试验形态学检查法3H-TdR掺入法MTT比色法淋巴细胞转化的检测方法形态学检查法

转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞过渡型细胞大小(直径μm)12～2012～166～8核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无未转化和转化淋巴细胞的形态特征原理：刺激物37℃56hG1期→S1期

合成DNA↑

3H-TdR37℃16hDNA-3H-TdR测淋巴细胞内放射量（cpm）计算SI判断淋巴细胞转化程度外周血（T）G0期3H-TdR掺入法评价：该方法敏感性高、客观性强、重复性好、可自动操作；设备昂贵、放射污染。

刺激指数（stimulatingindex，SI）

SI=试验管cpm均值/对照管cpm均值3H-TdR掺入法放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋巴细胞转化试验原理示意3H-TdR摻入法原理:用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定TH1/TH2细胞的百分率。淋巴细胞内细胞因子检测（二）T细胞分泌功能检定分泌的细胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++

Thl和Th2分泌的细胞因子原理:靶细胞抗原T细胞观察杀伤活力致敏CTL靶细胞（三）T细胞介导的细胞毒试验试验方法:同位素法

淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr释放测定γ射线51Cr特异释放率=

×100%（三）T细胞介导的细胞毒试验（三）T细胞介导的细胞毒试验背景无效应细胞效应细胞/靶细胞1:1效应细胞/靶细胞5:1效应细胞/靶细胞20:1细胞溶解特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验（四）体内试验溶血空斑试验酶联免疫斑点试验体内试验二、B细胞功能检测（一）溶血空斑试验溶血斑补体抗血清包被绵羊红细胞（二）酶联免疫斑点法抗体产生B细胞抗原包被酶联抗抗体凝胶底物显色刺激体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。（三）体内试验染色计数离心取上清测LDH或AKP测发光强度测CPM值形态法酶释法放射性核素释放法流式细胞术靶细胞溶解常用靶细胞:K562细胞株三、NK细胞活性检测返回章目录

﹡大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统

﹡小吞噬细胞:即中性粒细胞第五节其他免疫细胞功能检测技术吞噬细胞的种类特征性标志CD14分离技术Pecoll密度梯度分离法流式细胞仪分离技术免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法

黏附法一、吞噬细胞的分离（一）单核细胞的分离☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取（二）巨噬细胞的分离聚合物加速沉降法可从外周血中分离出白细胞RBC血浆(抗凝血)WBCRBC

Ficoll分离法可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞（三）中性粒细胞的分离Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。（一）中性粒细胞功能检测技术（二）巨噬细胞功能检测技术二、相关功能检测细胞趋化功能的检测吞噬功能的检测杀菌功能的检测（一）中性粒细胞功能检测体内试验法：皮肤窗法体外试验法：滤膜渗透法琼脂糖平板法趋化功能检测——检测细胞运动功能皮肤窗法在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12，24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后开始聚集，达50～100个，6小时可达1000个以上。

原理及技术要点

在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，37℃温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。滤膜渗透法原理及技术要点

在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加趋化因子，右孔加对照液，温育4～8小时后，用显微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和向右孔的移动距离B，计算趋化指数。趋化指数=A/B趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强

琼脂糖平板法显微镜检查法

吞噬指数=（一）中性粒细胞吞噬功能检测NBT还原试验

原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黄色）甲chan（紫黑色）杀菌功能检测

方法：1.抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），37℃孵育25min。2.推片染色、镜检。正常值：NBT阳性细胞率应≥95%NBT还原试验炭粒廓清试验