细胞试验技术及基本知识

细胞的冻存和复苏一、原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在一130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的一5〜0℃,细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。二、操作步骤（一）冻存1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5x108ml左右。4、将悬液分至冻存管中，每管1ml。5、将冻存管口封严。如用安甑瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。7、按下列顺序降温：室温-4℃（20分钟）一冰箱冷冻室（30分钟）一低温冰箱（一30℃1小时）-气态氮（30分钟）一液氮。注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1〜1.5月。（二）复苏1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。三、试剂和器材器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安甑瓶）、离心管、吸管、离心机等试剂：0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）附：冻存液配制：培养基加入甘油或DSMO,使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。细胞系或细胞株的建立一、概念1、细胞系（CellLine）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（LineageofCells）所组成。2、细胞株（CellStrain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecellstrain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuouscellstrain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。二、建立细胞系（或株）的要求什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；个体性别、年龄；取材的器官或组织。如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。2、细胞生物学检测：了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。三、若干细胞建株的要点及基本过程（一）肿瘤细胞培养技术要点1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。（二）人类淋巴母细胞建株方法1、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2mlRPMI1640。2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。4、加RPMI16405ml洗涤白细胞两次。5、将白细胞接种至1mlRPMI1640培养基中，加入10m环胞霉素和100m的EBV（EB病毒）液，混匀。6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺后乂/:^）加入10M环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l—2次，并维持环胞霉素的浓度。9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加1—2ml培养基，37℃培养10—15天，一般每隔3—4天观察一次，决定是否换液，传代。10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。个别组织细胞的培养体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下一、上皮细胞培养上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫1981）1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5-1平方厘米小块。2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃,30—60分钟。6、反复吹打，制成悬液。7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。二、内皮细胞培养内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。三、神经胶质细胞培养神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。养方法如下：1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细胞密度。5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。四、肌组织培养各种肌组织均可用于培养，以心肌和骨骼肌较实用。（一）骨骼肌细胞培养1、出生1—2天的乳鼠，引颈处死。2、无菌取大腿肌组织，切成0.3—0.5cm2小块后，用不含钙镁离子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过。3、计数调整细胞密度。4、快接种量2x106/皿入培养基培养。5、培养基内含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促进分化。接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化，明胶配置：用Hanks液配成0.01%明胶。该细胞接种率约50%,细胞生长开始呈纺锤形，培养50-52小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止，此时可观察到横纹，一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。（二）心肌细胞培养心肌细胞是最早的培养材料，Carrel曾长期培养过心肌组织，至今心肌仍不失为好的培养物，最常用的是鸡胚心肌。心肌比较容易培养和生长，可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法，均可获良好的效果。取心室肌培养较好，原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，培养成功时，一周后可见节律性收缩现象。五、巨噬细胞培养巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2-3周，多用做原代培养，难以长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。2、引颈处死小鼠。3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3-5秒。4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧.使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。7、小心拔出针头，把液体注入离心管。8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10mlEagle培养基。9、计数细胞。每只鼠可产生20-30x106细胞，其中90%为巨噬细胞。10、以3x105个贴附细胞/平方厘米接种。11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。六、肾小球分离、移植培养SD大鼠颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡1〜2分钟，2次，置超净台内，打开腹腔取出肾脏剪碎，置含Hank’s液的无菌培养皿洗涤，置80目不锈钢筛网上。用扁平自制小铲轻轻碾磨产物微小组织透过筛网，滤过组织Hank,s液混合物用吸管吸至120目不锈钢筛网，滤过，去小组织块，滤过物吸至200目不锈钢筛网，轻轻滤过，Hank,s液洗涤1次，收集网上肾小球，镜下观察为分离良好的肾小球。肾小球用0.2%胰酶、0.1%胶原酶，37℃消化20分钟，加血清终止胰酶反应，离心除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至24孔培养板或25ml培养瓶，使肾小球大于60个/cm2,加培养基5〜10ml（培养基组成：F12—3T3上清1：1；5%马血清；2.5%胎牛血清；胰岛素5gg/ml；25ng/ml氢化可的松；5gg/ml转铁蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲状腺素0.02ng/ml；D-缬氨酸150ng/ml）肾小球培养8〜10天，去除肾小球未生长组分，细胞继续培养24小时，形态学观察：细胞生长成单层多角型细胞，直径约10011m。制备KI-3T3培养基:KI培养基成分有DMEM/F12培养基，含4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）10mmol/L、ITS-X（含转铁蛋白0.55g/L、亚硒酸钠67mg/L、胰岛素1g/L）青霉素105U/L链霉素100g/L,3T3培养基成分有DMEM培养基（高糖型），含200g/L胎牛血清、HEPES10mmol/L、谷氨酰胺2mmol/L、丙酮酸钠2mmol/L、青霉素105U/L、链霉素100mg/L。KI培养基和3T3培养基1:1体积比混合，即为KI-3T3母亲苴培养基。七、裸小鼠移植瘤单细胞分离培养无菌条件下取出小鼠移植瘤组织，剪成1mm3小块，用0.5%胶原酶室温消化30分钟到1小时，再加等体积0.2%胰酶消化5〜8分钟，在消化过程中用吸管吹打组织块或用自制装置（分别作为加样和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接而成，滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞）来回推动注射器吹打组织以分离单细胞，终止酶消化方法同上。常规方法接种培养收获细胞。细胞培养用液的配制与消毒.HEPES溶液：HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N'-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。1mol/LHEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS238.38，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（2。1^）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。.谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4c冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1〜4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。.肝素溶液的配制:含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为℃。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。.I型胶原酶：0.1%1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为I型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。.明胶溶液：因为明胶难于过滤，所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）一即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入501^小瓶中，4℃保存。其他培养用液的配制：20ug/ml内皮生长因子，注意事项：.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2,可在配制时调PH至7.4。细胞传代培养（消化法）具体操作：一.传代前准备：.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。.胰蛋白酶消化；.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。.吹打分散细胞：.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。.分装稀释细胞：.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5X105/ml。最后要做好标记。.继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个十，占50%为++,占75%时为+++。传代细胞培养注意事项：.严格的无菌操作.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。附：EDTA（0.02%乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：（可能会用到）EDTA0.20g,NaCl8.00g,KCl0.20g,KH2Po40.02g,葡萄糖2.00g,0.5%酚红4ml,加入蒸馏水定容至1000m1。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。细胞的复苏细胞复苏的原则一快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。具体操作一. 实验前准备：.将水浴锅预热至37℃.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。二.取出冻存管：.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。.迅速解冻：.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。.平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min离心3min.制备细胞悬液：.吸弃上清液。.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。.细胞计数：细胞浓度以5X105/ml为宜。.培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作：.准备工作：取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。.细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。.细胞计数：1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4%）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铭（每个大格含有16个中铭）中没有被染液染上色的细胞数目。.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml= （四个大格子细胞数/4） X2X104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）X1.0mm（宽）X0.1mm（高）=0.1mm3而1ml=1000mm3.细胞计数要点：.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。.初学者易犯的错误：.计数前未将待测悬液吹打均匀。.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。.滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。.本实验特殊试剂的配制：（有些悬浮细胞计数会用到，可以计算活细胞的比率）4%台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4%即可。细胞的冻存（我们直接使用冻存盒放入-80℃过夜后放入液氮）.先将冻存管放入4c冰箱，约40min。.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。.置于-80超低温冰箱中放置过夜。.置于液氮罐中长期保存。5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。注意事项：.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。.不宜将冻存细胞放置在0℃〜-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。人淋巴细胞分离1,取人的外周血2ml于抗凝管中2,加入无菌的PBS2ml于管中进行稀释，（PBS需要提前放入室温最好）3,在15ml离心管中加入4ml（室温放置一会）淋巴细胞分离液4,将血液缓慢加入到分离液中，400g20min使细胞分层（第二层白色为需要细胞）5,获得的淋巴细胞用PBS2-6ml重悬以后500g20min,重复两次6,获得的淋巴细胞用淋巴细胞（PBMC）培养液重悬后计数，种于六孔板上（之后两天换一次液）Hips细胞的分化7,上述细胞七天后，电转（有专门的试剂盒，及质粒配方）8,用PBMC培养液重悬后（24h后）计数加入到MEF细胞上（ips培养液+FGF2+VC+NaB）9,到第八天时候换成MEF上清（两天换一次液）10,到第十二天时候，NaB不在加了，同时如果此时MEF细胞少了（会死掉）可在里面加入丝裂霉素处理过的MEF细胞20w左右，直到长出克隆小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的分离1,取怀孕13天的小鼠，脱臼而死，消毒2,取出胚胎后，剪去小鼠的四肢后，放在EP管中剪碎，用预热的胰酶37℃消化30min（消化期间不时晃动有利于充分消化）3,加入DMEM（10%FBS）中和后，筛网过滤（不过滤也可以）后，种于10cmdish（一般两个胚胎一个10cmdish）原代小鼠足细胞的培养1）制备KI-3T3培养基:KI培养基成分有DMEM/F12培养基,含4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）10mmol/L、ITS-X（含转铁蛋白0.55g/L、亚硒酸钠67mg/L、胰岛素1g/L）青霉素105U/L链霉素100g/L,3T3培养基成分有DMEM培养基（高糖型）,含200g/L胎牛血清、HEPES10mmol/L、谷氨酰胺2mmol/L、丙酮酸钠2mmol/L、青霉素105U/L、链霉素100mg/L。KI培养基和3T3培养基1:1体积比混合，即为KI-3T3培养基。2）差异过筛法分离肾小球:颈椎脱臼法处死小鼠,在无菌条件下，取出双肾，置于预冷的细胞培养基。去除肾包膜，剪碎肾皮质。在200\150\80um筛网上,10ml注射器针芯轻轻辗压肾皮质，不时用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗，收集过筛悬液，在300目筛网上一次过滤细胞悬液，收集300目筛网上的肾小球.在倒置显微镜下观察肾小球形态。3）种植肾小球:KI-