家畜育种学14动物育种学新技术课件

/jcyzx/index.htm第十四章家畜育种新技术

（生物技术在动物育种中的应用）第一节生物技术概述第二节

细胞工程技术的应用第三节

基因工程技术的应用/jcyzx/index.htm一、生物技术的概念生物技术（Biotechnology）其英语的本意是“生物工艺学”，一些论著又将其译为“生物工程”，其定义至今没有一个十分经典的表述，常见的表述有两种：从微观上认识和控制生物遗传与繁殖过程的技术。在探索生物所具有的多种多样功能的同时，用工程设计的方式把这些功能应用于各个领域、或人工摸拟再现生物功能，为人类提供产品或服务的新兴技术。第一节生物技术概述/jcyzx/index.htm生物技术是以生命科学研究成就为基础的综合性技术，是从微观上认识和控制生物的遗传物质和遗传过程，了解生命的全貌，其目的是要解决人类社会中的人口、粮食、肉蛋奶、环境能源医疗等各种具体问题。二、生物技术应用的目的/jcyzx/index.htm四、在家畜育种中应用的生物技术细胞工程技术细胞遗传学技术动物繁殖学技术基因工程技术分子遗传学技术（主要涉及基因组分析技术、DNA诊断技术、转基因技术等）分子数量遗传学技术/jcyzx/index.htm染色体及染色体片段移植与重组染色体组型与单个染色体的鉴别细胞遗传学技术动物繁殖学技术人工授精配子低温冷冻保存X、Y精子分离同期发情、超数排卵与分娩控制卵母细胞的体外培养与体外授精胚胎冷冻保存与胚胎移植核移植与细胞克隆嵌合体的制备/jcyzx/index.htm分子数量遗传（molecularquantitativegenetics）学。将分子生物技术和方法与数量遗传学相结合，研究数量性状基因座（QuantitativeTraitsLoci，QTL）定位与分子标记辅助选择（MolecularAssistantSelection，MAS）的理论和方法。这一学科领域的发展，将给家畜育种带来一次新的飞跃。分子遗传学技术基因结构与功能的分析基因组分析基因诊断基因克隆与基因组文库的建立转基因技术基因在微生物中的表达转基因动物的制备生物反应器/jcyzx/index.htm第二节细胞工程技术的应用人工授精技术配子低温冷冻保存技术同期发情、超数排卵技术体外受精技术性别控制与胚胎性别鉴定技术克隆技术/jcyzx/index.htm建立了AI育种体系（AggregativeIndexBreedingSystem）在畜群中广泛应用人工授精技术，精液全部来自经遗传评定验证的种公畜；在育种群中实施大规模的、规范化的生产性能测定；通过“定向选配”，有计划地培育后备公畜；组织科学、严格的公畜后裔测定，并应用先进的数据统计分析方法估计育种值，提高选种的精确性。一、人工授精技术给家畜育种带来的效应/jcyzx/index.htmAI育种体系在猪育种中取得的效果：在上个世纪80年代末90年代初，AI育种体系开始在猪育种中应用，至今，猪的主要生产性能已有大幅度提高。瘦肉率可达65%以上；70日龄以后的日增重最高可达2000g以上；料肉比可达2.5∶1，接近鸡的饲料利用率。一、人工授精技术给家畜育种带来的效应/jcyzx/index.htm人工控制母畜发情，更准确地掌握母畜的繁殖生理周期，适时输精，大大提高了母畜受胎率。通过同期发情处理，便于实施遗传改良措施。如实施胚胎移植、冷冻精液的输精等，都有必要进行同期发情处理。超数排卵技术的应用，可提高母畜繁殖率。人工促进母畜性早熟，实现提前配种，可缩短世代间隔，加快遗传进展。产后人工催情，缩短母畜胎间距，提高种畜使用效率，从而提高育种效益。三、同期发情、超数排卵与分娩控制/jcyzx/index.htm三、胚胎移植与MOET核心群育种体系MOET——是超数排卵（MultipleOvulation）与胚胎移植（EmbryoTransfer）是两项相互联系的生物技术的缩写。超排是基础，胚移是手段。人们习惯将两项技术统称为胚胎移植，用“MOET”表示。MOET在家畜育种中可实现的一般效应扩大优秀母畜在畜群遗传改良中的作用。利用胚胎冷冻保存技术，有效地保存家畜品种资源。冷冻胚胎的进出口，消除了家畜品种之间的地理隔离，促进优良种畜的基因交流，加速育种进程。冷冻胚胎的传递，可获得正常情况下难以得到的育种材料。MOET可使一些遗传素质十分优秀，但因繁殖障碍而无法妊娠的母畜延续其在育种中的作用；甚至克服种间隔离，挽救濒危动物。/jcyzx/index.htmMOET核心群育种体系——基本流程示意图供体母畜（人工授精站）核心公畜群青年公畜群胚胎母畜核心群ET—幼畜♀♂青年家畜性能测定站（测定生长发育性状）生产群MOET♂♀育成生产群核心群/jcyzx/index.htm卵母细胞采集卵母细胞体外成熟精液预处理体外受精胚胎体外培养与胚胎移植迄今，体外受精在各主要技术环节上的效率还不够高，总体技术水平还未达到应用的要求，胚胎工程学家们正在探索新的技术途径，如供体的活体取卵技术、腔前期或小腔期卵细胞的体外培养技术等。因此，体外受精技术的全面应用尚需一段时间。但仍可预测该技术在家畜育种和生产中广阔的应用前景。四、体外受精（在牛和羊的胚胎生产中得到部分应用）（一）技术步骤：/jcyzx/index.htm大幅度降低胚胎的生产成本，若与超排技术相结合，可生产更多的可移植胚胎。使优秀母畜产生更多的胚胎和后代，扩大优良基因在群体中的影响；对不小心宰了的优秀个体，还可利用其卵巢，通过体外受精继续在育种上加以利用。在母畜更新率一定的情况下，利用体外受精生产胚胎，可降低种母畜的留种率，提高母畜选择强度，加速群体遗传进展。在同胞测定中，应用体外受精技术可增加同胞数量，提高种畜选择的准确性。（二）体外受精技术的应用前景/jcyzx/index.htm（一）性别控制的效应提供更多表现限性经济性状的个体（如母牛、母鸡、雄鹿等），对性别影响生产性能的畜种（如猪、肉牛、家蚕、马等），则能多生产雄性动物，提高动物生产的专门化程度和生产效率。对广泛使用人工授精技术的畜种，公畜饲养量有限，则可通过性别控制增加母畜数量，提高母畜选择强度，加快母畜遗传进展。通过性别控制实现不同阶段对公母比例的需要。在杂交育种中，不同阶段对公母比例的需要不同。如，肉牛杂交育种的初始阶段需要更多的杂种母牛，而在横交固定阶段则需要选育一定数量的公牛，生产群中希望有更多的公牛用于肥育。五、性别控制与胚胎性别鉴定/jcyzx/index.htm（二）性别鉴定的作用性别鉴定后可对单胎动物实施同性别双胚移植，提高生产效率。性别鉴定是胚胎克隆的必要技术环节。胚胎克隆之前，首先要进行胚胎性别鉴定。五、性别控制与胚胎性别鉴定/jcyzx/index.htm胚胎克隆及其应用前景取8-32细胞期的胚胎卵裂细胞核去核的成熟卵子发育成新个体移植电融合、体外或体内培养1、获得更多的胚胎，进一步提高MOET及其核心群育种体系的效率。理论上，一个32细胞期的供体胚胎，经过两次克隆即可得1024个胚胎。2、获得数量很大的遗传同质个体，为遗传效应、参数估计和育种值估计提供更准确的信息，提高估计的精确度。3、在MOET核心群育种体系中，快速建立具有特定基因组合的多个纯系。4、迅速推广胚胎克隆家畜，提高生产总体水平。现阶段，胚胎克隆还有许多技术问题有待研究解决。但可预期，5-10年后这项技术将达到应用水平。其应用的潜在领域有：/jcyzx/index.htm取体细胞的细胞核去核的成熟卵子发育成新个体移植电融合、体外或体内培养尽管这项技术获得成功的报道屈指可数，达到应用水平的时间也尚难预测，但动物遗传育种学家们仍十分关注这项技术的发展，并潜心研究它对未来家畜遗传育种产生的效应。由于体细胞克隆可产生已知基因个体的复制品，且移植所需细胞核来源不受限制，其意义远大于胚胎克隆。体细胞克隆体细胞克隆的技术难度远大于胚胎克隆。/jcyzx/index.htm第三节基因工程技术的应用生产转基因动物进行基因诊断研制基因疫苗分子遗传标记应用前景/jcyzx/index.htm一、生产转基因动物（一）转基因动物的概念转基因动物是指将体外重组DNA（rDNA）移植到成熟卵泡中，使rDNA整合到核基因组中发育而成的动物个体。生产转基因动物的目的是使整合到动物核基因组中的rDNA高效表达，改变受体的生理特征或产生新的功能。/jcyzx/index.htm提高生产性能。如通过转生长激素基因或生长激素释放因子基因，可提高动物生长速度；转外源半胱氨酸生物合成基因羊，其羊毛生长速度大幅度提高。提高产品质量。如转乳球蛋白基因奶牛和奶山羊，其奶中的乳蛋白构成受到改变，大大提高了奶的质量和价值；再如，将调控蛋白结构基因转入羊或蚕中，可以改变羊和蚕支持蛋白的合成，改变羊毛或蚕丝成份，提高其质量。实现抗病育种。如转外源Mx-基因猪具有强抗流感病毒能力；转乳铁蛋白基因奶牛，具有很强的乳房炎抗病力。（二）转基因动物的价值/jcyzx/index.htm成本高。转基因的成功率极低，约为0.06%；转基因动物为半合子，传代不稳定；转基因的表达率低，甚至不表达；转基因品种无专利保护。转基因动物具有负面效应外源基因的导入可能诱发基因组中其它基因突变、失活或激活致癌基因，造成遗传缺陷或个体致死；载体DNA表达产生的负作用，如反转录病毒载体DNA的非生理性表达，扰乱正常生理功能；转基因本身的负作用，如转人生长激素基因鼠，其生长速度提高、乳腺发育提前、母鼠繁殖力降低甚至不育等。（三）转基因动物的缺点/jcyzx/index.htm基因诊断的技术手段：PCR（PolymeraseChainReaction）、RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphisms）、SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism）等技术。基因诊断的目的为育种提供配种方案。实现对种畜的基因型选择，在选育群中淘汰有害或不利基因。二、基因诊断/jcyzx/index.htm基因诊断技术已在猪、牛、羊育种中得到了广泛应用。目前能诊断的基因主要有：猪的氟烷基因（Hal）、雌激素受体基因（ESR）、酸猪肉基因（RN）、生长激素基因（PGH）等；牛的双肌（DoubleMuscling）基因；羊的产羔数（Booroola）基因等。现以猪的Hal基因为例来介绍基因诊断的技术要点及其在育种中的应用。基因诊断技术应用情况/jcyzx/index.htm提取基因组DNA进行PCR进行PCR-RFLP分析，判定基因型制定育种方案分析基因型与表型的关系在一定条件下，体外扩增目的基因。这是基因诊断的关键技术。从动物任何组织中均可获得基因组DNA用特定内切酶消化PCR产物后，电泳分离酶切片段，根据酶切片段多态性判定基因型。基因诊断的技术环节/jcyzx/index.htm-+从组织中获得的动物基因组DNA电泳图谱

（琼脂糖凝胶）/jcyzx/index.htm659bp-+659bp猪Hal基因PCR产物电泳图谱

（琼脂糖凝胶）/jcyzx/index.htmnnNnNN猪Hal基因PCR-HhaⅠ-RFLP电泳图谱

（琼脂糖凝胶）1543994695515377237Marker-+NNnnNnNN/jcyzx/index.htm四川省三大外种猪及新荣Ⅰ系氟烷基因分布/jcyzx/index.htm猪PGH基因PCR产物电泳图谱

（琼脂糖凝胶）-+/jcyzx/index.htm猪PGH基因PCR-BstⅪ-RFLP电泳图谱

（琼脂糖凝胶）-+/jcyzx/index.htmCCCCCCCCCCCCCCAAACAAACBCCD猪PGH基因PCR-ApaⅠ-RFLP电泳图谱

（聚丙烯酰胺凝胶）-+/jcyzx/index.htm三、研制基因疫苗伪狂犬病基因工程苗伪狂犬病基因缺失苗大肠杆菌基因缺失苗K88、K89/jcyzx/index.htm（一）遗传标记的概念及其发展概念：遗传标记是指那些可准确鉴别、能反映个体特异性的遗传特征。遗传标记应具备的条件：具有丰富的多态性；数量多，且覆盖整个基因组；等位基因间呈共显性，能准确判别所有可能的基因型；其测定不受年龄、性别、环境等因素的限制。遗传标记的发展：形态学标记细胞学标记生化标记DNA分子标记。四、分子遗传标记/jcyzx/index.htmRFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphisms）：指用同一限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，所获得的含有同源序列的酶切片段在长度上存在的差异。这是最早开发的DNA标记，在同一基因座上只有两个等位基因，多态性不够高，且测定方法比较复杂，近年已很少使用。AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms）：用特定引物，通过PCR反应，复制并扩增不同个体基因组DNA模板，所得DNA片段在长度上的差异。该方法较RFLP简单，但需要设计和合成特定引物，且AFLP标记可能是显性的，无法区分纯合子与杂合子。（二）DNA分子标记的类型/jcyzx/index.htmRAPD（RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA）：这也是基于PCR的分子标记，用随机序列组成的寡核苷酸作为引物通过PCR反应获得的长度不同的多态性DNA片段。该方法的重复性性较差，且多数RAPD标记为显性标记。SNPs（SingleNucleotidePolymorphisms）：指单个核苷酸突变而产生的多态，只有两个等位基因。虽其多态性不高，但在基因组中SNP的数量很大。如人类基因组中，单核苷酸突变的概率为10-6左右，人类基因组约含30亿个碱基，因而平均每1000个碱基就有1个以上的SNP标记。测定SNP最快速准确的方法是用DNA芯片技术。（二）DNA分子标记的类型/jcyzx/index.htmVNTR（VariableNumberTandemRepeat）：在真核生物基因组中存在许多串状重复序列，如CACACA…

或GTGTGT…

，由于重复单位在个体间有很大差异，因而可作为一种遗传标记，不同的重复次数就构成不同的等位基因。按重复单位大小可分为微卫星标记和小卫星标记。微卫星标记（MicrosateliteMarker）的重复单位在6个碱基对以内，或称简单序列重复（SimpleSequenceRepeat，SSR）。小卫星标记（MinisateliteMarker）的重复单位大于6个碱基对。对DNA的微卫星多态性，可设计特定引物通过PCR加以鉴别。对小卫星多态性，可用重复单位的同源序列作为探针进行RFLP分析。（二）DNA分子标记的类型/jcyzx/index.htm微卫星标记：M5PCR扩增及电泳结果-+/jcyzx/index.htmRAPD标记：R93PCR扩增及电泳结果-+/jcyzx/index.htm微卫星MCW0120扩增产物变性聚丙烯酰胺电泳检测-+/jcyzx/index.htmABI遗传分析程序检测微卫星标记图谱图中共有7个微卫星标记，获得PCR产品后，用ABI遗传分析技术20分钟获得的结果。该图谱还可进行群体的精确系谱鉴定，即通常讲的亲子鉴定。该技术还可以用以进行遗传病的基因诊断。目前正在研究一次获得20个以上标记的程序，已经通过初步实验。/jcyzx/index.htm分子标记为我们提供了非常丰富的遗传育种信息，这些信息可用于：用于QTL检测；用于标记辅助选择；研究品种起源与发展；用于标记辅助基因的导入；标记辅助杂种优势的利用；标记辅助遗传资源的保存；亲子鉴定等。其中前3项是目前家畜遗传育种中研究得最多的内容，可望在家畜育种中得到广泛应用。（三）DNA分子标记的作用/jcyzx/index.htm概念：QTL（QuantitativeTraitLoci）理论上是指所有影响数量性状的基因位点。实际上，通常是将那些有较大效应的、可被检测出的基因或染色体片段称为QTL。当一个QTL就是一个基因时，该基因就是主效基因。若对影响数量性状的各个单基因都有清楚的了解，将大大提高对数量性状选择的有效性的准确性，同时还可利用克隆、转基因技术等对群体进行遗传改良。QTL检测的方法：主要有标记-QTL连锁分析法（Marker-QTLLinkageAnalysis，又称基因组扫描法）和候选基因分析法（CandidateGeneApproach）两种。1、QTL检测/jcyzx/index.htm构建资源群体选择标记收集数据构建标记连锁图QTL的检测与参数估计一般家畜群体中，标记与QTL可能处于连锁平衡状态，需要设计特定的资源群体，以产生足够的连锁不平衡。近交或杂交试验设计、家系试验设计。根据所选资源群、试验经费、技术水平、工作条件等，选择适当类型和数目的标记。对分子遗传标记基因型测定的数据；需要检测的数量性状表型值测定的数据。测定标记所在的连锁群（染色体），估计标记间的相对距离（用重组率或图距表示），确定标记的排列顺序。根据已确定的遗传图谱，利用已测得的标记基因型及其表型值，用统计分析方法估计QTL在染色体上的位置、基因频率、效应大小等。标记-QTL连锁分析/jcyzx/index.htm以回交试验设计为例来说明M-QTL连锁分析亲本♂♂×♀♀F1M1Q1M2Q2M2Q2M2Q2M2Q2M2Q2回交一代M1Q1M1Q1♂♂×♀♀M1Q1M2Q2M2Q2M2Q2M1Q2M2Q2M2Q1M2Q2亲本型个体重组型个体/jcyzx/index.htm这是利用微卫星标记绘制的绵羊1、2号染色体连锁图谱/jcyzx/index.htm该研究通过组建F2

分离群体，构建了鸡RAPD连锁图谱，用区间作图分析法，对鸡19种产肉性状基因位点（QTL）进行定位和效应分析。连锁图谱包含32个RAPD标记，分布于5个连锁群；检测到控制17种产肉性状的QTL35个，控制鸡胫长的主效基因2个。该论文在畜牧兽医学报发表，全国家禽研究会交流，引起同行专家高度重视。★鸡产肉性状与分子标记的连锁分析/jcyzx/index.htm标记-QTL连锁分析法的优、缺点优点：成功率高。可检测出基因组中所有的QTL。因为标记覆盖整个基因组。缺点:成本高，耗时长。因测定标记基因型及个体数多。统计分析难度大。方法及计算复杂，统计量的分布不确定，对多性状、多染色体分析时犯Ⅰ型错误的概率大。很难精确定位。只能给出QTL位点的一个估计值或一个置信区间。不便应用。实际育种群多为远交群体，标记与QTL间的关系因家系而异，用标记-QTL连锁分析找到的QTL很难直接用于这些群体。/jcyzx/index.htm候选基因法候选基因：已知在性状发育或生理过程中具有某种生物学功能并经测序的基因，这些基因可能是QTL基因。候选基因法：从一些可能是QTL的基因中筛选出QTL的方法。/jcyzx/index.htm选择候选基因获得用于扩增基因的引物序列揭示候选基因内的多态性建立大规模测定候选基因基因型的方法选择进行候选基因分析的群体研究候选基因与性状的关系证实所发现的候选基因与性状的关系，并确定其是否是QTL根据所掌握的生物学或生理学知识、或标记-QTL连锁分析的结果选择候选基因。从现有基因库中寻找，或自行设计特异性引物。用PCR-RFLP或SSCP等方法进行研究。PCR-RFLP和SSCP是目前用于大规模检测基因型的主要方法。原则上，任何群体都可用于候选基因分析，但最好是候选基因的平衡群体（未经选择的地方品种群或常规育种的商业化育种群）。否则不易区分候选基因与其连锁的其它基因的效应。可分析候选基因各多态位点与性状的关系，也可分析整个候选基因与性状的关系。/jcyzx/index.htm采用候选基因法对猪产仔数分子标记及其效应的研究结果通过对ESR、PRLR、FSHR和RYR1四个基因与猪产仔数间的关系及第八号染色体上的9个微卫星分析研究，初步确立了三个新的猪产仔数分子标记：雌激素受体基因（ESR）第八外显子内的ESRB酶切位点。促卵泡生长激素受体基因（FSHR）第七外显子的FSHRB酶切位点。猪第八号染色体上的SWR1101微卫星。/jcyzx/index.htmESR基因的BB基因型；ESRB酶切位点的AA型；FSHRB酶切位点的BB型；猪催乳素受体(PRLR)基因的AA基因型；RYR1基因的BB基因型等。用这5个分子遗传标记选择母猪，群体窝平产仔数可提高2.2头。对提高母猪产仔数有利而不影响仔猪生长的分子标记有5个/jcyzx/index.htmESR基因的AA基因型；ESRB酶切位点的BB型；FSHRB酶切位点的AA型；PRLR基因的BB基因型；微卫星SWR1101的BD基因型。对提高母猪产仔不利的分子标记也有5个/jcyzx/index.htm候选基因分析法的优、缺点优点统计检验效率高。只要是QTL，就能检测出来。应用范围广。只需一个世代的群体，结果可用于任何群体。成本低，容易实施。因为是对单个基因进行分析，而非对整个基因扫描。便于应用。一旦确定某个候选基因就是QTL，可直接用于遗传评估，而不必借助其它标记信息。缺点不能找出所有的QTL。难以确定候选基因就是QTL。除非候选基因的效应非常大，否则其效应很有可能是与其连锁的一个或几个相邻QTL之间连锁不平衡造成的。所以在候选基因的效应未被明确证实之前，不能轻易下结论/jcyzx/index.htm1）标记辅助选择的基本原理最理想的情况是基因辅助选择——通过测定QTL基因型，直接选择理想基因型的个体。如猪的Hal基因ESR基因RN基因、羊的Booroola基因、肉牛的DoubleMuscling基因等。标记辅助选择（MarkerAssistantSelection）：当QTL的基因型不能直接测定，只能根据标记信息推测时，就可根据与QTL紧密连锁的Marker进行选择。

2标记辅助选择（MAS）/jcyzx/index.htm标记辅助选择的前提

若M与QTL在传代过程中有可能发生重组，就会导致选择错误。因此，进行标记辅助选择的前提条件是：①父亲在Marker和QTL上都必须是杂合子；②父亲的Marker和QTL的连锁相已知；③能准确判断后代从父亲处获得了哪个Marker等位基因（母亲的Marker基因型是纯合子）。/jcyzx/index.htmMAS的优越性增加遗传评定的准确性进行早期遗传评定降低遗传评定的成本获得更大的遗传进展和育种效益/jcyzx/index.htmMAS的基本策略A保持现行的育种方案，但同时利用标记信息、表型信息和系谱信息对个体进行遗传评定。提高遗传评定的准确性！2）标记辅助选择的策略/jcyzx/index.htmMAS的基本策略B两阶段选择降低育种成本！基因型选择EBV选择第一阶段：(生产性能测定之前)第二阶段：(生产性能测定之后)利用标记或主基因信息利用表型和系谱信息性能测定2）标记辅助选择的策略/jcyzx/index.htmMAS的基本策略C早期选择缩短世代间隔！选择基因型信息亲代信息同胞信息繁殖生物技术+2）标记辅助选择的策略/jcyzx/index.htmQTL效应的大小。Marker与QTL的连锁程度。选择的世代数。常规选择的效率。常规选择非常有效，则标记辅助选择的效应不显著；反之，常规选择效率越低，则标记辅助选择的优势越明显。3）影响标记辅助选择的效率的因素/jcyzx/index.htm★