第六章-微生物的遗传变异与菌种选育

第七章微生物遗传变异与育种第一节遗传变异的物质基础第二节基因突变与诱变育种第三节基因重组与杂交育种第四节原生质体融合第五节基因工程第六节菌种的衰退、复壮和保藏本章教学目标：1.掌握微生物基因突变的类型、特点和机制。2.掌握微生物分离纯化的方法步骤。3.掌握营养缺陷型突变菌株的筛选方法和具体应用。教学重点与难点：质粒、营养缺陷型、野生型和原养型菌株、菌种衰退、饰变和杂菌污染的区别；优良食品发酵特性菌株的筛选；微生物分离纯化的方法步骤。教学课时：7.5学时教学方法：多媒体教学本章详细知识点微生物遗传变异的基本原理☀微生物遗传变异的物质基础及其存在形式。☀微生物基因突变的基本原理（类型、特点和机制）。☀微生物基因重组的基本原理（方式和特点）。微生物菌种的选育

☀

野生型微生物菌菌株分离、筛选与纯化。☀微生物的诱变育种的工作程序和方法步骤。☀营养缺陷型突变菌株的筛选方法和具体应用。☀原生质体融合育种技术的操作程序。

☀

基因工程育种技术的操作步骤和取得的成就。

☀

微生物菌种退化的原因；掌握菌种复壮的方法、防止菌种退化的措施以及菌种保藏的方式和原理。概述

微生物加工制造和发酵生产各种食品的过程中，想有效大幅度提高产品产量、质量和花色品种,首先必须选育优良的生产菌种。而优良菌种的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的。遗传和变异是相互关联，同时又相互矛盾对立的两个方面，在一定条件下，二者是相互转化的。认识和掌握微生物遗传变异的规律是搞好菌种选育和关键。第一节遗传变异的物质基础

一、证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验

二、遗传物质在细胞中的存在方式三、核酸的结构与功能四、微生物的基因组第一节遗传变异的物质基础

一、证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验

1.肺炎双球菌的转化实验2.噬菌体的感染实验3.烟草花叶病毒的拆开与重组实验

Streptococcuspneumoniae(肺炎双球菌）一般很多菌株形成荚膜的是具致病性的，菌落表面光滑（smooth），称S型，不形成荚膜的，无致病性，菌落外观粗糙，称R型，一般由S型突变而来。1.注射R型活菌2.注射S型灭活菌3.注射S型活菌4.注射R型活菌+S型死菌细菌培养1.热致死S型菌2.R型活菌

3.热致死S型菌+R型活菌

4.R型活菌+S菌抽取提物肺炎双球菌的转化实验肺炎双球菌的转化实验（证实转化因子存在）转化因子的确定1944年，O.T.Avery等做了一个实验：从S型活菌中分离提取荚膜多糖、脂类、蛋白质、DNA和RNA等可能的转化因子，分别与R型活菌混合后，注射到小鼠体内，结果只有DNA引起R型转化，将无毒的R型转化成有毒的S型，导致小鼠死亡。证实了决定生物遗传变异的物质是DNA。加S菌的RNA和RNA酶噬菌体的感染实验

1952年，A.Hershey和M.Chase)利用示踪元素对大肠杆菌及T2

噬菌体进行了这类实验。用含35S和32P两种元素的培养基培养大肠杆菌，然后让T2噬菌体侵染培养后的大肠杆菌，使T2

噬菌体分别打上35S和32P的标记。噬菌体的感染实验让这两种T2

噬菌体侵染不含标记元素的大肠杆菌，并在T2

噬菌体完成吸附和侵入后，强烈搅拌洗涤，使吸附在菌体外表的T2

噬菌体蛋白质外壳脱离细胞并均匀分布，再进行离心沉淀，分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。结果发现，几乎全部35S都在上清液中，而几乎全部32P和细菌一起出现在沉淀物中。

蛋白质外壳根本不可能进入宿主细胞，进入宿主细胞的只有噬菌体的DNA，且子代噬菌体例子具有同亲代一样的蛋白质外壳。实验证明，有且仅有DNA携带有全部的遗传信息。噬菌体的感染实验

烟草花叶病毒的拆开与重组实验

将烟草花叶病毒拆成RNA(该病毒不含DNA)和蛋白质，并分别对烟草进行感染实验；结果，只有RNA能感染烟草，且感染后的寄主，可分离到完整的具蛋白质外壳的烟草花叶病毒。而后将烟草花叶病毒和霍氏车前花叶病毒拆开，在体外分别将两种病毒的RNA和蛋白质分别结合，进行重组。再把这些经重组的病毒分别感染烟草。结果从寄主分离所得的病毒蛋白质均取决于相应病毒的RNA。证明了核酸(RNA)是烟草花叶病毒的遗传物质基础。植物病毒的拆开与重组实验

RNA是此病毒的遗传物质基础1.用表面活性剂处理标准TMV，得蛋白质；2.用弱碱处理TMV的变种HRV（霍氏车前花叶病毒），得RNA；3.重建获得杂种病毒；

*用标准TMV和HR抗血清证实杂种病毒的外壳来自标准TMV株。二、遗传物质在细胞中的存在方式

（一）细胞水平从细胞水平看，遗传物质存在于细胞核；此外，细胞质中存在能自我复制的遗传物质，即质粒。（二）亚细胞核水平核内DNA与组蛋白结合在一起构成染色体。（三）分子水平DNA（RNA）－－→在DNA大分子上存在着决定某些遗传性状的特定区段，即所谓基因－－→一个基因含若干核苷酸碱基组成的三联密码。四种核苷酸，按其排列组合方式的不同，可编出三联密码43＝64个，用于决定组成蛋白质的20种氨基酸顺序（详见课本P121）。起始密码（AUG）和终止密码（UAA、UGA和UAG）。

S-脱氧核糖P-磷酸A-腺嘌呤G-鸟嘌呤C-胞嘧啶T-胸腺嘧啶DNA的结构和复制方式三、核酸的结构与功能

DNA和RNA的结构比较

糖磷酸骨架碱基对含氮碱基DNA的一级结构是指四种核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按一定顺序排列，通过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸，由于核苷酸之间的差异仅是碱基的不同，故又可称为碱基序列。

DNA的二级结构

双螺旋结构模型(doublehelixmodel)

DNA的三级结构与功能——

DNA超螺旋

双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。研究发现，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。四、微生物的基因组1.基因（Gene,Mendelianfactor）：是指携带有遗传信息的DNA或RNA序列，也称为遗传因子，是控制性状的基本遗传单位。

2.基因组（genome）是指存在细胞或病毒中的所有基因。3.真核微生物有两套基因，又称为双倍体(diploid)，其基因组指细胞中单套染色体及其上的基因；一个基因一般为1000bp~1500bp;细菌一般是一套基因，即单倍体（haploid）。几种微生物与几种代表生物的基因组

（一）真核生物基因组结构特点

包括：染色体DNA和染色体外DNA，分别存在于细胞核内和线粒体、叶绿体中。（二）原核生物基因组结构特点

包括：核基因组DNA和染色体外DNA，分别存在于细胞质和质粒中。质粒的类型：抗药性质粒（R因子）、致育因子（F因子）、产细菌素质粒、降解性质粒、其他质粒第二节

微生物的基因突变与诱变育种一、基因突变（一）几个基本概念（二）基因突变的类型（三）基因突变的特点（四）基因突变自发性和不对称性的实验证明（五）基因突变的机理（六）自然界突变菌株的分离与筛选二、微生物的诱变育种（一）从自然界中分离筛选菌种的方法步骤（二）诱变育种一般步骤和方法（三）变异菌株的初步筛选一、基因突变（一）几个基本概念突变基因突变突变率回复突变自发突变诱发突变（二）基因突变的类型（1）形态突变型（细胞、菌落、噬菌斑等形态突变）（2）条件致死突变型（如，温度致死条件突变型）（3）生化突变型（如营养突变型）（4）抗性突变型（5）产量突变型（6）其他突变型如，毒力突变、糖发酵突变、产品突变按突变体表型不同，可分以下几种类型：（1）形态突变型细胞形态突变、菌落形态突变、噬菌斑形态突变

体细胞突变花色体突变（2）条件致死突变型温度敏感型突变（Ts突变株）

E.coli的某些菌株：37℃下正常生长，不能在42℃下生长

某些T4噬菌体突变株：25℃下可感染其E.coli宿主，在37℃却不能感染（3）营养缺陷型（生化突变型）如（组氨酸缺陷型）

his1c-

缺陷型

hisc+

野生型（生长谱法）FABCDEG基础培养基菌液1ml注入灭菌培养皿中，倒入融化冷却至40℃～50℃的基本培养基，摇匀放平待凝固，共做两只培养皿。

(2)将2只培养皿等分7格并标记(如左图)，依次放入混合氨基酸(包括核苷酸)、混合维生素和脯氨酸(加量要很少，否则会抑制菌的生长)，37℃恒温箱培养24～48h，观察生长圈，某一格内出现圆形混浊的生长圈时，即说明是某一氨基酸、维生素或核苷酸的缺陷型。（4）抗性突变型strs表示对链霉素敏感；strr表示对链霉素有抗性；

penr

青霉素抗性突变（5）产量突变型产量显著高于原始菌株者，称为“正变株”（高产株）；产量低于原始菌株者，即称“负变株”。

筛选高产正变株的工作对生产实践极其重要（在育种实践上）：诱变育种、重组育种、遗传工程育种。

饰变饰变，微生物在不同生理阶段或在不同外界环境条件下，在形态学和生理学方面往往出现未涉及遗传型改变的表型变化。不属变异范围。如，醋酸杆菌，37℃时，菌体形态较短，相互连接；培养温度升高时，菌体细胞伸长；温度降低时，菌体细胞呈柠檬型。（三）基因突变的特点由于生物界遗传变异的物质基础是相同的，因此在遗传变异的本质上都具有相同规律，这在基因突变水平上尤其突出。（1）不对应性（2）自发性

（突变性状与原因无直接对应关系）（可在无人为的诱变因素处理下自发地产生）（3）稀有性（4）独立性（自发突变率10-6～10-9）（某一基因突变对其他基因的突变无影响，如抗性突变）（5）诱变性（6）稳定性（可通过物理、化学处理提高<10～105>突变率）（可稳定地遗传）（7）可逆性（突变基因相对稳定，个别细胞中可出现回复突变）（四）基因突变自发性和不对称性的实验证明1.变量彷徨试验：实验过程：取噬菌体T1的敏感大肠杆菌对数期肉汤培养物，用新鲜培养液稀释成浓度为103／m1的细菌悬液，然后在甲、乙两试管内各装10m1。把甲管中菌液分装50支小试管(每管装0.2m1)，保温24～36h，再把各小管菌液分别倒入50个预先涂有T1的平板上，经培养后分别计算各皿上所产生抗T1的菌落数；乙管中的10ml菌液不经分装先整管保温24～36h，才分成50份加到同样涂有Tl的平板上，经适当培养后，同样分别计算各皿上产生的抗性菌落数。结果，来自甲管的50皿中，各皿间抗性菌落数相差极大，而来自乙管的则各皿数目基本相同。这说明大肠杆菌抗噬菌体性状的突变，不是由所抗环境因素——噬菌体诱导的，而是在接触噬菌体前，某次细胞分裂过程中随机自发产生的。这一自发突变发生越早，抗性菌落越多，反之则越少。噬菌体在此仅起着淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用。1.变量实验1.变量实验结论：1)抗性细胞的出现，在接触噬菌体之前；

2)喷上噬菌体，淘汰野生型和鉴别抗性株；

3)由于甲管高度彷徨，说明突变是随机的。

对噬菌体T1敏感2.涂布实验实验过程：在12只培养皿平板上各涂以数目相等(5×104)的噬菌体Tl的敏感大肠杆菌细胞，经5h培养，约繁殖12.3代，在平板长出大量微菌落(每个菌落约含5100个细菌)。取其中6皿直接喷上Tl噬菌体，另6皿先用灭菌玻棒把微菌落重新均匀涂布一遍，然后同样喷上相应的T1。经培养过夜后，计算这两组培养皿板上所形成的抗噬菌体菌落数。结果发现，经涂布的长出抗性菌落353个，未经涂布的仅28个菌落。这意味该抗性突变发生在未接触噬菌体之前。结论：1）突变与噬菌体无关；

2）涂布使抗性菌株均匀分布；

3）抗性突变可在任何时间发生，与噬菌体存在无关。

以上实验用统计学原理间接证明。2.涂布实验3.平板影印培养试验

基本过程：把长有数百个菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱上，使其上沾满来自培养皿平板上的菌落。然后把这一“印章”的菌落一一接种到不同选择性培养基平板上。培养后，对各平板相同位置上菌落作对比，即可选出适当突变型菌株。结果证明：微生物抗药性在未接触药物前自发产生，这一突变与相应药物环境毫不相干。（五）基因突变的机理诱发突变及其机理：

1.碱基对的置换（例如，A-T→

G-C）⑴直接引起置换的诱变剂（亚硝酸、羟胺和各种烷化剂

）⑵间接引起置换的诱变剂（碱基类似物，部分烷化剂

）

2.碱基颠换（例如，T-A→

A-T）

3.移码突变

（核苷酸的增添或缺失，打乱该部位以后的全部密码）（诱变剂为吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙等）1.碱基对的置换碱基对的置换可分成两个亚类：一类是DNA链上的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换，称为转换；另一类是DNA链上的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换，称为颠换

A：T

T：A

A

T

C：G

G：C

C

G

双链DNA

单链DNA

（实线代表转换，虚线代表颠换）由碱基置换引起的突变型

物理诱变剂：紫外线、射线、γ-射线。诱变机理：紫外线照射下，发生光化学反应，产物主要是嘧啶二聚体和嘧啶水合物，引起DNA结构改变，导致微生物死亡。或由于碱基转换或移码突变，引起微生物发生突变。诱变剂正确碱基配对形成的氢键氨基酮基偶尔，T会以烯醇式出现；C会以亚氨基形式出现化学诱变剂：碱基类似物、烷化剂、亚硝酸盐及吖啶类①碱基类似物的置换作用（胸腺嘧啶T的类似物5-溴尿嘧啶<BU>和5-溴脱氧尿苷<BD>，腺嘌呤A的类似物2-氨基嘌呤<AP>）5-BU烯醇式与G配对5-BU酮式与A配对碱基类似物的作用是通过活细胞代谢活动掺入DNA

分子中，引起碱基对置换，是间接的。5-BU是T的代谢类似物。5-BU以酮式状态时可替代T，与A配对；5-BU以烯醇式状态时替代C，与G配对；5-BU可通过烯醇式和酮式结构的变化，引起碱基对置换。

H:C

↗

H:C-→G:C

↗

H:C→G:C

↗

A:T→H:T-----→A:T亚硝酸类引起的碱基对置换亚硝酸可直接诱发含氨基的碱基对发生转换。先使碱基中的氨基氧化脱氨，从而使腺嘌呤（A）变成次黄膘呤（H），而后由于H和C配对，因此当DNA再次复制时，A:T转换为G:C。烷化剂的诱变作用

烷化剂的化学结构都带一个或多个活性烷基，能转移到核酸分子中电子密度极高的位置上，通过烷化磷酸基形成烷化嘌呤和烷化嘧啶作用于正常的DNA，特别是经常形成烷化鸟嘌呤。一般认为，烷化作用导致基因突变的机制：（目前尚未定论）①与碱基类似物相似，引起碱基配对的错误。②烷基在鸟嘌呤引起脱嘌呤作用，使鸟嘌呤从DNA链上脱落下来，进而引起DNA复制时碱基对的缺失和置换。烷化剂的诱变作用（其活性烷基能转移到核酸分子中电子密度极高的位置上。）R（烷基）烷化7烷化7R糖烷化剂引起的碱基转换：G-CA-T胸腺嘧啶T吖啶类染料移码突变移码突变一种诱变剂引起DNA分子中一个或少数几个碱基插入或缺失，使该部位后全部遗传密码发生转录错误的一类突变。有效诱变剂有吖啶类染料及其化合物，如:三氨基吖啶、吖啶黄、吖啶橙、5-氨基吖啶。普遍认为诱变机制是：吖啶类化合物的平面型三环分子结构与一个嘌呤:嘧啶碱基对相似，因此能嵌入两相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋部分解开，在DNA复制过程中，会使链上插入或缺失一个碱基，引起移码突变。丫啶类化合物诱发的移码突变图示：吖啶类化合物2.自发突变的机制

1背景辐射和环境中多因素低剂量的诱变效应（高温、强辐射）2微生物自身代谢产物的诱变效应（过氧化氢）3互变异构效应（G、T第六位上的<酮基烯醇式>和A、C<亚氨基形式>的出现，导致T-G,C-A的配对错误，造成自发突变）4环状突出效应（某一单链偶尔产生一小环，其上的基因越过复制发生遗传缺失，造成突变。）（六）自然界突变菌株的分离与筛选1．采样2．增殖培养3．分离培养4．菌落选择5．筛选调查研究，设计实验方案最适条件富集培养选择培养基，检出平板划线分离或平板倾注分离典型菌落的选择采集生态环境的确定摇瓶培养，一株一瓶一株3-5瓶选1-3株淘汰80%-90%再淘汰80%-90%摇床或小型发酵罐培养全面测定和生产试验二、微生物的诱变育种微生物育种主要包括以下四方面：①菌种分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。②菌种培育：改良已有菌种生产性能，使产品的质和量不断提高，或使之更适于工艺要求，这是育种工作的任务。③菌种的保藏：要使生产菌种避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。④退化菌种的复壮：设法恢复生产性能下降的菌种，这是菌种复壮工作的任务。（一）从自然界中分离筛选菌种的方法步骤采样

增殖培养

纯种分离

纯培养

生产性能测定

方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离就是使培养物获得单个菌落：1．稀释分离法2．平板划线分离法

⑴

涂菌⑵

划线分离：①分步划线法

②一次划线法

3．组织分离法

测定代谢产物或其它目的性状（二）诱变育种一般步骤和方法

出发菌株

同步培养

使菌细胞处于相同或接近的生理状态

单细胞（或单孢子）菌悬液制备

单细胞或单孢子的意义

酵母或霉菌孢子106/ml、细菌108/ml

诱变剂的选择及其剂量的确定

以致死率为70％～75％

为宜

诱变处理

①物理诱变剂

②化学诱变剂①确定出发菌株②菌种的纯化选优

↓←出发菌株的性能鉴定③同步培养④制备单细胞（或单孢子）悬液

↓←活菌浓度测定⑤诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验⑥诱变处理⑦平板分离

↓计形态变异的菌落数，计算突变率⑧挑取疑似突变菌落纯培养⑨突变体的初步筛选

↓←用简单快捷的方法⑩重复筛选

↓←摇瓶发酵试验⑾选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）（三）变异菌株的初步筛选

纸片培养显色法

透明圈法琼脂块培养法

1筛选用培养基⑴基本培养基：凡能满足某野生型菌株营养要求的最低成分合成培养基；以‘[-]’表示；⑵基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称完全培养基，‘[+]’表示；⑶基本培养基中有针对性地加入某一或某几种营养缺陷成分，以满足相应营养缺陷型生长的培养基，称补充培养基，可按所加营养成分相应用‘[A]’、‘[B]’等来表示。（三）营养缺陷型的筛选及其应用

2．营养缺陷型菌株筛选的一般方法（1）诱变剂处理（2）淘汰野生型菌株①抗生素法②菌丝过滤法（3）检出营养缺陷型

（4）鉴定营养缺陷型

3.检出营养缺陷型①点植法

②限量补充培养法

③影印接种法

4.鉴定营养缺陷型①含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。②营养缺陷型营养类别的鉴定。③缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。

20种氨基酸的排列编组

第一组第二组第三组第四组第五组第六组第七组第八组第九组丙氨酸谷氨酸亮氨酸丝氨酸精氨酸谷氨酰氨赖氨酸苏氨酸天冬酰氨甘氨酸蛋氨酸色氨酸天冬氨酸组氨酸苯丙氨酸酪氨酸半胱氨酸异亮氨酸脯氨酸

缬氨酸将多种营养因子编组，如：一组：1

2

3

4

5

二组：2

6

7

8

9三组：3

7

10

11

12四组：4

8

11

13

14五组：5

9

12

14

15一、原核微生物的基因重组与育种（一）转化（transtormation）（二）转导（transduction

）（三）接合（conjugation

）（四）溶源性转变二、真核微生物的基因重组与育种（一）有性杂交（二）准性生殖第三节微生物的基因重组与杂交育种第三节微生物的基因重组与杂交育种

基因重组又称遗传重组，指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经遗传分子重新组合，形成新遗传型个体（重组子）的过程。

重组是分子水平上的概念，可理解为遗传物质分子水平上的杂交；一般说的杂交是细胞水平上的概念。

杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。基因重组的类型真核微生物中有性杂交，准性生殖；原核微生物中有转化、转导、接合和溶源转变等都是基因重组在细胞水平上的反映。概念：受体菌（receptor）直接吸收来自供体菌（donor）的DNA片段，通过交换，把它整合到自身基因组中，获得供体菌部分遗传性状的现象。转化后受体菌称转化子。一、原核微生物的基因重组与育种

（一）转化（transtormation）特点：1.可使营养缺陷型和原养型、抗性菌株和敏感菌株之间互换，还可引入新的基因。2.低频率发生。3.不同菌株间，种间或属间都可能引起转化。4.受体菌必须处于感受态（最易于接受外源DNA片段并能实现转化的生理状态）。过程：①

从供体菌提取转化因子的双链DNA片段；②

转化因子与感受态受体菌表面特定位点结合；③

结合位点上，转化因子的一条单链逐步降解，而另一条链逐步进入受体细胞。④进入受体细胞的单链与受体菌染色体组上同源区段配对，受体菌染色体组相应单链片段被切除并被取代，形成杂种DNA区段；⑤受体菌染色体复制，杂种区段一分为二，一个恢复，一个形成转化子。

操作程序：供体菌培养至对数期培养感受态受体菌

利用转化进行育种离心，收集菌体溶解菌体离心，取上清液加95%乙醇使DNA絮状沉淀供体DNA备用加新鲜培养基振荡培养0.5—2h加入供体菌DNA溶液继续培养0.5—2h后转化子检出概念：通过缺陷体为媒介，把供体DNA片段携带进受体细胞，通过交换与整合，使受体菌获得供体菌这部分遗传性状的现象，称转导。（二）转导（transduction

）转导噬菌体的来源：1.噬菌体裂解敏感菌后释放出来；2.溶源性菌内的原噬菌体被诱导而释放出来，出现几率10-6～10-5。特点：供体菌和受体菌并不直接接触，通过转导噬菌体感染过程，把供体菌DNA带入。

通过缺陷型噬菌体或温和型噬菌体为媒介，将供体细菌细胞中DNA片段携带到受体细菌细胞中，从而使受体细菌获得供体细菌的某些遗传性状的现象，称为转导。

根据媒介噬菌体的不同，转导分普遍性转导和局限性转导两类。

1．普遍性转导完全缺陷型噬菌体（完全不含自身DNA的缺陷型噬菌体）为媒介，把供体菌DNA部分片段误包（而非整合），当它感染受体菌时携至受体细胞，使后者获得这部分遗传性状的现象，称普遍性转导，转导频率为10-5～10-8。（又分完全普遍性转导和流产普遍转导）

2．局限性转导由部分缺陷的温和噬菌体侵染把供体菌少数特定基因携至受体菌，并与后者基因组整合、重组，获得表达的转导现象，称局限性转导，转导频率为10-6。转导类型

完全普遍性转导流产普遍性转导转导噬菌体转导后外源DNA只位于受体细胞染色体组的同源区段，不进行交换、整合和复制，只进行转录、转译和性状表达。特点：转导的遗传物质呈单线遗传。单线转导可保持数代，很少为稳定性重组子。局限性转导特点：1.只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合点两侧的基因）；2.该基因由部分缺陷的噬菌体携带；3.缺陷噬菌体形成过程是因为发生了“误切”或双重溶源菌的裂解形成。感染开环，整合不正常切离部分缺陷噬菌体概念：指供体菌通过性菌毛与受体菌相接触，前者传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌遗传性状的现象。（三）接合（conjugation

）四种接合型E.coli菌株F因子存在方式及其相互关系不正常分离F’因子与染色体组整合与F+接合分离或消除分离或消除与F’因子接合与核染色体组整合脱离F-（♀）F+（♂）F’（♂）Hfr（♂）F因子细菌接合现象中，细菌有性别分化，决定因子为F因子，凡有F因子的细胞，就有相应的性菌毛存在。⑴F+与F-杂交过程：①F因子的一条DNA单链在特定位置上断裂；②断裂后的单链逐步解开，并以另一留存的环状单链做模板，通过模板滚动，一方面把解开的单链以5’-端为先导通过性菌毛推入F-细胞中；③另一方面，供体细胞内，以滚动的环状DNA单链做模板，重新合成一条互补的环状单链<滚环模型>；④F-细胞中，外来供体DNA线状单链上也形成一条互补的新DNA单链，随后恢复成一环状的双链F因子；

⑤使F-菌株变成F+菌株。供体F+菌株受体F-菌F因子细菌染色体第一条链的转移新双链合成新链合成F+菌株过程：①Hfr与F-菌株接合，性菌毛使两细胞相连，前者染色体双链中一条单链在F因子连接处发生断裂，由环状变线状，F因子位于线状单链DNA末端，整段线状染色体（单链）以5’-末端引导，等速转移至F-细胞（耗时约100min）；②长的线状单链DNA常在转移过程中断裂，使F-成为一个部分双倍体，可双交换产生稳定接合子；⑵Hfr与F-杂交注意：越处于Hfr染色体前端的基因，进入F-的概率越高，此性状出现在接合子中的时间就越早。DNA在转移过程存在严格顺序性，每隔一定时间利用强烈搅拌（如组织捣碎器）可使接合中断，以获得不同数量Hfr性状的F-接合子。接合中断法：选用几种特定整合位置的Hfr菌株与F-菌株接合，在不同时间中断接合，可根据F-中出现的Hfr菌株中各种性状的时间早晚（用分钟表示），画出一幅比较完整的环状染色体图。组氨酸半胱氨酸精氨酸乳糖操纵子⑶F’与F+杂交过程：①Hfr的F因子不正常切离脱离染色体组时，重新形成游离但携带一小段染色体基因的特殊F因子(F’因子)。②携带F’因子的菌株，其选择性状介于F+与Hfr之间，称初生F’菌株；③通过F’菌株与F-菌株接合，使后者变成F’菌株，称次生F’菌株，同时获得来自初生F’菌株的若干新遗传性状。次生F’细胞是一个部分双倍体。以F’质粒传递供体菌基因的方式，称F因子转导（F-duction）。5’大肠杆菌接合（杂交）示意F+F-Hfr三种接合的结果：

F++F-2F+

F′+F-2F′Hfr+F-不同情况

Hfr+F-Hfr＋F-（多数情况下）

Hfr+F-Hfr＋Hfr（少数情况下）利用接合进行育种

的过程：①两个亲本菌株的选择，一般用Hfr和F-杂交；②Hfr和F-菌株混合培养，发生接合；③接合子的检出。（四）溶源性转变宿主菌在感染温和噬菌体后，由于噬菌体DNA整合到核DNA后，导致宿主菌某些新的遗传性状表达，即为溶源性转变。溶源转变与转导在本质上的不同：首先温和噬菌体不携带任何供体菌的基因。其次噬菌体是正常的完整的，不是异常情况下产生的缺陷型噬菌体。溶源转变的典型例子不产毒素的白喉棒状杆菌（Lorynebatcerium

diphthariac）菌株被噬菌体侵染发生溶源化时，会变成产毒素的致病菌株。其他如沙门氏菌、红霉菌、链霉菌等也具有溶源转变的能力。二、真核微生物的基因重组与育种（一）有性杂交

定义：微生物有性繁殖过程中，不同性细胞间的接合，随之发生染色体重组，从而产生新遗传型后代的现象，称有性杂交。凡能产生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能进行有性杂交。

生产实践举例有性杂交在被广泛用于优良品种的培育：如酒精发酵的酵母菌和用于面包发酵的酵母菌同属一种啤酒酵母（Saccharomyces

cerevisiae）的两个不同菌株，面包酵母的特点是对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生CO2多，生长快；而酒精酵母是产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱，所以酿酒厂生产酒精后的酵母，不能供面包厂作引子用。两者杂交，就可得到既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。二、真核微生物的基因重组

（二）准性生殖类似有性生殖，但更原始。定义：两个非异配型核的细胞接合后，形成异核体细胞，两核能发生低频率的接合与交换，产生具新性状的个体的生殖过程，叫准性生殖。基本过程：1.菌丝联结

形态上无区别，但遗传性状上有差别的两个同种亲本体细胞（单倍体）之间形成联结。

2.形成异核体

两单倍体细胞经联结后，细胞膜和细胞质发生融合，形成双相异核体。异核体能独立生活。3.核融合

异核体中的双核融合，产生双倍体杂合子核。核融合后产生杂合子核的频率极低，如构巢曲霉和米曲霉的为10-5～10-7。4.体细胞重组和单倍体化

双倍体杂合子极不稳定，有丝分裂过程中，极少数核中染色体会发生染色体交换和单倍体化，形成极个别的具新遗传性状的单倍体杂合子。单倍体（A）单倍体（B）细胞质融合异核体单倍体杂合二倍体异核体分离二倍体分离子体细胞重组稳定杂合二倍体单倍体分离子体细胞重组核融合准性重组的过程选择互补优良性状亲本菌，将其孢子混合培养多在孢子萌发初期，孢子培养基使孢子萌发，用时1—2周其分生孢子能在基本培养基上生长两种缺陷型亲本的孢子都不能萌芽其分生孢子不能在基本培养基上生长检出、分离、培养，纯化、再鉴别。紫外线、γ射线处理，促其染色体交换、染色体在子细胞中分配不均，染色体缺失或畸变以及各种不同基因组合形成的单倍体杂合子，使分离子进一步增加新性状变异的可能性。用准性重组进行育种广泛用于霉菌①亲本菌的选择；②异核体的形成与分离；③杂合二倍体的形成与分离；④分离子的诱发、检出和测定。一、原生质体融合原理具不同遗传性状的两个细胞，除去细胞壁后，其原生质体之间能在诱导剂聚乙二醇的作用下大大提高融合的频率和重组率（一般可达10-3—10-1）。第四节原生质体融合育种

二、原生质体融合育种

细胞（A+B-）

细胞（A-B+）脱壁

脱壁

原生质体（A+B-）

原生质体（A-B+）

混合

加融合剂（30%-40%PEG，分子质量6000）

（+Ca2+）

原生质体融合

涂平板（原生质体再生：细胞壁重建、细胞质分裂至生长）

形成菌落

检出重组子菌落（A+B+）亲本细胞，考虑单倍体，营养和抗性双重标记。细菌C’用青霉素或溶菌素；霉菌、酵母菌用裂解酶