化学发光免疫分析技术课件

化学发光免疫分析技术姓名：庞潇卿专业：生化与分子生物学目录发光及化学发光的原理与分类化学发光剂及其作用原理化学发光免疫分析的原理与操作应用与发展前景1234发光：是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。基态v0激发态v能量h.v普朗克公式，能量Ɛ=h.vh为普朗克常数，v为频率发光间接化学发光直接化学发光化学发光A+BC*C*C+h.vA+BC*C*+DC+D*D*D+h.v

化学发光的原理化学发光的分类酶促化学发光：

辣根过氧化物酶-鲁米诺（HRP-Luminol）系统碱性磷酸酶（ALP）系统黄嘌呤氧化酶系统非酶促化学发光：吖啶酯系统草酸酯系统

闪光（Flash）：发光时间在数秒内，如吖啶酯辉光（Glow）：发光时间在数十分钟以上，如：HRP-Luminol系统二氧杂环乙烷AP发光（AP-AMPPD）系统黄嘌呤氧化酶系统按化学反应类型按发光持续时间在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。可分为直接化学发光剂和酶促反应发光剂。化学发光剂能作为化学发光剂的条件：①发光的量子产率高；②它的物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；④其化学发光常是氧化反应的结果；⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。吖啶酯

在碱性条件下被H2O2氧化时，发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。

鲁米诺（Luminol）发光原理辣根过氧化酶

化学发光免疫分析(Chemiluminescenceimmunoass-ay,CLIA)，是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析和胶体时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术。化学发光免疫分析化学发光免疫分析类型直接化学发光免疫分析化学发光酶免疫分析电化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体（抗原），与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。直接化学发光的机理---夹心法磁微粒模式图YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特点抗原和抗体结合与未结合部分的易分离磁微粒技术磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料

此处添加内容该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（或抗原），在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图

化学发光免疫分析仪优点1.灵敏度高：CLIA关键的优越性，其灵敏度可达10-16mol/L(RIA为10-12mol/L)。2.宽的线性动力学范围：发光强度在4～6个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。3.光信号持续时间长：辉光型的CLIA产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天，简化了实验操作及测量。4.分析方法简便快速：绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式。5.结果稳定、误差小：样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，分析结果灵敏稳定可靠6.安全性好及使用期长：免除了使用放射性物质。

单光子计数器光电倍增管高压高速放大器高速比较器高速分频器发光样品产生光子激发光阴极产生光电子在阳极上形成较强信号脉冲信号相对发光单位数字脉冲(RLU)在各打拿极之间得到能量和数目的倍增化学发光免疫分析仪核心部件化学发光免疫分析的应用（二）

①Quan等建立了食品中伏马菌素B1的化学发光酶免疫分析方法，与伏马菌素B1的ELISA方法相比，其方法灵敏度提高了10倍。且通过样品的添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA分析方法与HPLC方法有良好的相关性。②Yang等建立了食品中葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化学发光免疫分析方法，通过将SEB抗体吸附在碳纳米管表面，然后将抗体－碳纳米管固定在聚碳酸酯表面，再通过增强化学发光免疫法测定SEB含量。

③Magliulo等建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。

④Lin等建立了农产品中黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析方法。同时，将建立的分析方法与黄曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试验，相关系数为0.9098，显示其有较好的应用前景。食品安全检测化学发光免疫分析的应用（三）

①Christian等通过化学发光酶免疫分析方法建立了环境内分泌干扰物炔雌醇的免疫分析方法，并通过建立的分析方法对表面水和污水处理厂的污水中的炔雌醇进行测定。

②Pittman等通过磁性小珠和生物素-亲和素为载体建立了水样和土样中2，4，6-三硝基甲苯的免疫夹心电化学发光免疫分析方法。

③Zhao等通过建立微板式磁化学发光酶免疫分析方法来对水样中17β-雌二醇进行检测。通过微板磁性分离器可避免前处理过程以达到高通量分析，再结合高灵敏度的化学发光体系，建立了该方法。环境科学发展与展望

化学发光免疫分析法具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、设备简单等优点，近年来在环境、临床、食品、药物检测中得到了广泛运用。实际检测常常需要对大量、复杂、低丰度的样品进行测定，因而化学发光免疫分析法逐渐向快速、高通量、高灵敏检测的方向发展。

化学发光成像技术、化学发光免疫分析与分离技术的联用，可以使免疫分析的选择性、灵敏度、检测速度和检测通量得到进一步提高。为了更好地适应临床、环境等领域的实际应用，需要大力发展微型化、集成化和自动化的化学发光免疫分析仪器。随着分子生物学及纳米与传感技术的进步，新的化学