聚合酶链式反应

关于聚合酶链式反应第1页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五一、PCR的定义在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。第2页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五PCR技术的创建Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术

1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第3页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五KaryB.Mullis（1944－）第4页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五二、PCR技术的优点特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍第5页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五三、PCR原理Sample1.denaturatation2.Primerannealing3.PrimerextensionRegiontobecopied第6页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五PCR技术原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。模板DNA变性：加热至94℃左右，双链DNA解离成单链；模板DNA与引物的退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；重复循环变性--退火--延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。第7页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五

PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C第8页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第9页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃第10页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物第11页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第12页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始第13页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第14页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束第15页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增第16页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五PCRproduct第17页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第18页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五PCR仪第19页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五四、PCR的标准反应体系10×扩增缓冲液10μl

4种dNTP混合物各200μmol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2μg

TaqDNA聚合酶2.5ul

（Mg2+）1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ulHome第20页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五五、PCR反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）第21页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五六、PCR的类型及应用1、PCR的类型反转录PCR技术：RNA的反转录与PCR的联合应用原位PCR技术：在细胞内进行，不需要提取DNA实时PCR技术：进行DNA的定量分析筑巢PCR彩色PCR多重PCR不对称PCR共享引物PCR差异显示PCR锚定PCR重组PCR第22页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五2、PCR的应用研究

-基因克隆、测序、分析突变诊断

-细菌、病毒、寄生虫检测、诊断人类基因组工程

-遗传图谱的构建、测序、表达图谱法医

-犯罪现场标本分析肿瘤检测其他……第23页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五法医学个人识别、亲子鉴定1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。第24页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五什么是“DNA指纹技术”？世界上除同卵双生外，几乎没有指纹一模一样的两个人，所以指纹可以用来鉴别身份。研究表明，每个人的DNA都不完全相同，因此