免疫学原理及检测课件

免疫学原理及检测中山大学中山医学院朱振宇教授医学博士、博士生导师免疫学一门自然科学，从研究机体对传染病的抵抗力开始，是微生物学的一个分支，但随着科技的发展，成为了一门独立的学科。免疫学反应是抗原与抗体的反应，仅在高等脊椎动物中存在。这是已知的最精妙复杂的身体抵御外部物质的系统。抗体(Antibody)机体受外来抗原物质刺激后，产生的一种能与该抗原发生特异性结合的免疫球蛋白(Ig)。免疫球蛋白分类Ig通常是指具有抗体活性和（或）抗体样结构的球蛋白。应用免疫电泳与超速离心分析可将Ig分5类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。IgG：含量最多或最主要的Ig（75%），唯一能够通过胎盘的Ig。主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞合成与分泌。IgM：分子量最大，由5个IgM单体通过J链连接。是最早出现的Ig，是抗原刺激后最早出现的抗体，其杀菌、溶菌、溶血、促吞噬以及凝集作用比IgG高500~1000倍IgG抗体的结构及与抗原的反应血清学反应的一般特点1、抗原、抗体的结合具有特异性，但当有共同抗原、抗体存在时，会出现交叉反应。2、抗原、抗体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。3、抗原、抗体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。4、血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原抗体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原抗体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。血清学反应的一般特点ELISA方法的技术根据抗原或抗体能结合到固相载体的表面，并保持其免疫活性。抗原或抗体与酶连接所形成的结合物仍保持免疫学和酶的活性。在测定时待测血清与固相载体的抗原或抗体结合，然后再加入酶标记的抗原或抗体，形成复合的结合物，最后加入底物溶液，与酶反应的颜色深浅与标本中相应抗原或抗体的量成比例。双抗体夹心ELISA法示意图影响因素试剂因素标本因素（内源性、外源性）操作因素试剂因素选择优良的检测试剂，操作前平衡到室温不同批号的试剂不能混用在有效期内使用标本因素(外源性干扰)标本应避免溶血，细菌的污染(假阳性)；抗凝不完全的标本(假阳性)，建议尽量不用抗凝剂血尤其是肝素抗凝剂；标本保留时间过长(间接法本底值增高)，如需保存一周以上，则应-20℃保存,融解后应充分混匀；标本间应避免交叉污染，不应与生化标本共用同一管标本；不能用NaN3防腐。操作时影响因素加样应加在孔的下1/3处，注意不可溅出或有气泡产生。加样应每人一吸头，防止交叉污染。样本的稀释(目的是减少非特异性反应)要先加稀释液再加标本并用微量振荡器混匀30秒。加试剂时应摇匀并弃去第一滴。洗涤应彻底。乙型肝炎病毒血清标志物检测为什么血清HBsAg阴性不能排除HBV感染？★检测试剂不够敏感。★S基因变异（抗原性发生改变）。★X基因变异（转录受抑制）。★重叠HCV感染（干扰HBsAg合成）。如何诊断血清HBsAg阴性的HBV感染？★提高检测敏感性★采用针对变异抗原的检测试剂★HBVDNA的检测★组织中标志物的检测HBsAb阳性HBVDNA阴性并不排除肝细胞内HBV的存在

★可出现在HBV感染的恢复期，此时HBsAg未

消失，HBsAb已产生，大部分归功于检测敏

感性的提高。★S基因发生变异，野生株HBsAb不能将其清

除；★HBsAb阳性者感染了不同亚型HBV或免疫逃

避株。HBsAg与HBsAb共存★是重要的免疫耐受因子，大部分情况下其存

在表示患者处于高感染低应答期。★

HBeAg与HBVDNA有良好的相关性。★阳性标本检出率90％左右。HBeAgHBeAg与HBeAb共存★血清转换过程中。★检测敏感性提高。★野生株与变异株同时存在。HBcAb★反映肝细胞受到HBV侵害的一种指标，主要包括

IgM、IgG、IgA。★抗HBcIgM阳性是最早出现的特异性抗体，是诊

断急性乙型肝炎和判断病毒复制活跃的指标，并

提示病人的血液有强传染性。也见于慢性活动性

肝炎。★抗HBcIgG其阳性滴度高，表明患有乙型肝炎，

指正在感染；低滴度为既往感染指标，体内时间

长。乙型肝炎病毒各项标志物

检测的临床意义乙型肝炎表面抗原(HBsAg)1、HBsAg阳性，常为慢性HBsAg携带者、急性乙型肝炎潜伏期、慢性迁延性肝炎与慢性活动性肝炎、肝硬化。2、HBsAg阳性还可见于输血后肝炎病人的血中，有少数急性黄疸性肝炎的病人血中HBsAg呈阳性反应，随着病情的好转HBsAg消失。乙型肝炎表面抗体(HBsAb)1、HBsAb阳性证明以往有过乙型肝炎病毒感染的历史，机体产生了一定的免疫力。2、注射乙型肝炎疫苗或打过HBsAb免疫球蛋白，HBsAb可呈阳性反应。3、HBsAb是保护性抗体，血中抗体滴度在1:64或P/N>10以上时才对机体有保护作用。乙型肝炎e抗原(HBeAg）1、HBeAg增高说明患有乙型肝炎具有较强的传染性，它的出现往往是乙型肝炎的早期或者是活动期。2、如HBeAg阳性持续时间大于10周以上或更长时间，病人可能进展为慢性持续性感染，肝组织常有较严重的损害，急性乙型肝炎容易演变成慢性肝炎或肝硬化。3、HBeAg阳性孕妇有垂直传染性，9%以上的新生儿将受乙型肝炎病毒感染，HBeAg也为阳性。乙型肝炎e抗体(HBeAb)1、慢性乙型肝炎HBeAb阳性占48.3%，肝硬化为68.3%，肝癌为80%。2、HBeAb阳性率增高，表明多数患者乙型肝炎病毒感染的时间可长达7－27年。

3、HBeAb阳性仍会有一定的传染性。在HBeAb阳性的孕妇分娩婴儿中可有20%感染乙型肝炎病毒。乙型肝炎核心抗体(HBcAb)1、乙肝核心抗体IgM增高可诊断急性

乙型肝炎。2、单纯核心抗体IgG增高常表示有既往

感染。3、HBcAb的出现表明肝内乙肝病毒复制

活跃，肝细胞受损较重，并且传染性

较强。4、HBcAb对乙型肝炎无保护作用，其持

续阳性可长达数十年甚至保持终身。临床二对半检测常见模式HbsAg-HBsHBeAg-HBe-HBc1＋－＋－＋2＋－－＋＋3＋－－＋－4－－－＋＋5＋－－－＋6－－－－＋7－＋－＋＋8－＋－－＋－＋－－

－

10－

－－－

－

模式1：急肝、慢肝活动期，有传染性，（大三阳）。模式2：急性乙肝、病毒复制减弱；慢性乙肝、传染性弱（小三阳）。模式3：急性HBV感染，趋向恢复，慢性HbsAg携带者。模式4：近期既往感染，急性HBV感染恢复期。模式5：急肝、慢肝表面抗原携带者，传染性弱。模式6：急性窗口期，既往感染过。模式7：康复期，近期感染过HBV，有免疫力。模式8：既往感染过，乙肝恢复期，仍有免疫力。模式9：康复期或被动免疫后。模式10：现在或过去未感染乙型肝炎病毒。

？建议每个病人都要进行

HBVDNA检测

HBVDNA检测的临床意义1、诊断方面：⑴HBVDNA是HBV存在最直接的依据⑵HBVDNA是HBV复制的标志⑶HBVDNA是患者具有传染性的标志（4）对HBV-M起补充作用：①HBeAg(﹣)/HBeAb(﹢)乙型肝炎（前C区变异）②HBsAg(﹣)乙型肝炎（S区变异）③低水平感染单项抗HBc(﹢)乙型肝炎HBVDNA检测的临床意义

2、疗效判断：

HBVDNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效

最敏感的指标。3、预后判断：HBVDNA水平与病情有一定的关系。HBVDNA检测的临床意义调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBVDNA来决定。为什么建议每个病人都要进行

HBVDNA检测？！HBsAg和HBeAg均阳性而HBVDNA阴性可能的原因：干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBVDNA很少或缺乏。丙型肝炎HCV抗体不是保护性抗体，是存在HCV感染的标志。抗HCVIgM在发病后即可检测到，一般持续1～3个月。如果抗HCVIgM持续阳性，提示病毒持续复制，易转为慢性。低滴度抗HCVIgG提示病毒处于静止状态，高滴度提示病毒复制活跃。HCVRNA

HCVRNA阳性是病毒感染和复制的直接标志。HCVRNA亦可定量，定量测定有助于了解病毒复制程度、抗病毒治疗的选择及疗效评估等。为什么要同时检测

抗HCV及HCVRNA？

★抗病毒治疗的要求。

★防止漏诊。有报道223例丙型肝炎病例中，抗HCV和

HCVRNA同时阳性86例，单纯抗HCV阳性

118例，单纯HCVRNA阳性19例。表明单做其中一项可能导致漏诊。艾滋病血清学检测

★初筛试验：酶联免疫吸附试验（ELISA）用于对检测对象感染情况的初步筛查，检测结

果可能会有假阳性，不能发抗体阳性报告。

★确认试验：免疫印迹法（WesternBlot）确定检测对象是否有HIV抗体，可发抗体阳性

报告。

第一代ELISA试剂标记抗原：全病毒裂解抗原优点：灵敏度高，可检出各种抗体缺点：制备麻烦，成本高，假阳性★1985年，FDA批准第一个HIV抗体筛选试剂第二代ELISA试剂标记抗原：重组或合成多肽抗原优点：重组抗原可消除HLA所致的抗体假阳性，生产成本低.不使用HIV病毒颗粒，较为安全，敏感性特异性较高缺点：仍有一定的假阳性★1990年，FDA批准第一个重组抗原筛选试剂。第三代ELISA试剂标记抗原：重组或合成多肽优点：可检测所有不同种类的抗体，增加了试剂的敏感性和特异性

★1994年发展了双抗原夹心法，酶标物由抗人

IgG改变为特异性HIV抗原。第四代ELISA试剂标记物：重组或多肽抗原+重组抗体优点：同时检测HIV抗原抗体，缩短窗口期注意：抗原检测敏感性低于单独抗原试剂(20~100pg/ml,3.5~10pg/ml)★1998年第四代试剂首次上市。快速检测试验特点：1、操作简便、快速；2、普通室温下可以完成，无需特殊仪器；3、判读受主观因素影响。适用范围：野外、紧急情况。HIV“窗口期”第一代HIVAb:6-8星期第二代HIVAb:4-5星期第三代HIVAb:±3星期第四代HIVAb/Ag:±2星期ELISA法检测假阳性的原因由于仪器或加样头造成的交叉污染底物被金属离子污染潮湿或试剂滴漏洗板不充分读取错误生物因素抗体初筛试验的局限性阳性结果不能确认，需用其他试剂复查。阴性结果不能排除HIV感染：在感染早期，血清阳转前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗体可能检测不到（如p24抗体）。反应中抗体过量，抗原抗体比例不合适而不能形成特定结构，出现凝集抑制。不能诊断<18月龄婴儿的母婴垂直感染。新出现的亚群难以检测。梅毒（syphilis）由梅毒螺旋体引起的慢性全身性疾病梅毒螺旋体每30～33小时繁殖一次，为厌氧微生物，在体外很容易死亡梅毒分为三期：一期和二期梅毒病程在2年以内称为早期梅毒，三期梅毒病程已超过2年称为晚期梅毒

传播途径：主要为性行为传播，少数通过间接感染或血液起源及流行情况

15世纪末,梅毒起源并广泛流行于欧洲,通过商业往来，也进入了我国，于1505年在广东省首先发现梅毒病例，此后，梅毒便从沿海到内地在我国广泛传播开来，发病率居高不下，居性病之首。

解放后，党和政府有效地取缔了妓院，对性病进行广泛的普查普治，经过十年的努力，已于1959年基本上消灭了梅毒。

1964年我国向全世界宣布基本消灭了性病，这一举动震惊了世界，轰动了全国。1979年我国再次出现梅毒,且报告病例数逐年增多。1993年到1999年之间年均增长85%，2000年全国梅毒报病数为80181例，是1993年的40倍。2000年我国8种性病中梅毒位居第三占9.33%。世界各国积极防治在美国、澳大利亚、加拿大以及欧洲发达国家等，