生化实验报告

本文格式为Word版，下载可任意编辑——生化实验报告生物化学试验报告

姓

名：

学

号：

专业年级：

组

别：

试验室

第一部分

一、试验目的

把握程度试验主要目的

1.把握盐析法分开蛋白质的原理和基本方法

2.把握凝胶层析法分开蛋白质的原理和基本方法

3.把握离子交换层析法分开蛋白质的原理和基本方法

4.把握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法

5.了解柱层析技术二、试验原理

把握程度原理具体内容

不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的区别，可分

清蛋白

球

蛋

白

A

11

22

等电点

4.88

5.06

5.06

5.12

6.85-7.3

相对分6.9

20

30

9-15

1.6-30子质量

含量

57-6

2-5

4-9

6.2-12

12-201.在pH6.5溶液中，清蛋白解离而带负试验名称

血清清蛋白、--球蛋白的分开纯化与定量

试验时间

试验地点

指导老师

组员

评分

批改日期

离纯化各种蛋白质

电荷，同时(1、(2、(-球蛋白也会解离而带负电。

2.由于清蛋白的等电点，分子量最小所以解离而带的负电荷量最多。

3.(-球蛋白的等电点高于pH6.5所以解离而带正电荷。

把握程度相关方法原理

粗提原理-盐析法1.由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。

2.调理盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分开的目的。

脱盐原理-凝胶层析1.盐析分开的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必需先脱盐后才能进一步纯化。蛋白质分子大，无机盐分子小。通过凝胶层析即可将大小不同的物质分开开来。

2.凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分开的技术。

纯化原理-离子交换层析离子交换层析是指滚动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分开。

纯度鉴定-血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都

醋酸纤维素薄膜电泳低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、外形及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

一、

材料与方法

1、试验材料

本次试验仪器

1.层析柱2.电泳仪3.电泳槽4.加样枪、试管、载玻片、盖玻片等本次试验试剂

1.葡聚糖凝胶G-25(SephadexG-25)层析柱2.二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱3.饱和硫酸铵溶液4.各不同浓度的pH6.5醋酸铵缓冲溶液5.20%磺基水杨酸溶液6.1%BaCl2溶液7.pH8.6巴比妥缓冲溶液8.氨基黑10B染色液、漂洗液

2、试验流程

3、操作步骤：

粗提脱盐纯化鉴定盐析法进行粗分开葡聚糖凝胶G-25层析

DEAE纤维素离子交换层析

醋酸纤维素薄膜电泳

4、考前须知药品1.所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生2.葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生,避免损耗，严禁倒掉!操作

1.使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。

2.上样时，滴管应沿柱上端内壁参与样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。

3.洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。

4.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的BaCl2混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。

其次部分

一、试验结果与处理

1、试验现象图片现象说明

边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液后，有白色沉淀产生，溶液呈浑浊状。

离心后分开沉淀和上清液，在沉淀中参与水溶解。

两个槽都出现白色沉淀分别是收集球蛋白的峰值和清蛋白的峰值前用磺基水杨酸检测蛋白质。

上清液过葡聚糖凝胶G-25层析柱时现象。

第一排其次排分别是球蛋白和清蛋白过G凝胶时用氯化钡检测硫酸根从阳性到阴性的现象。

电泳前醋酸纤维素薄膜放在电泳槽。

染色漂洗后的结果：从左到右依次为血清蛋白1管、血清蛋白2管、

球蛋白管、血清对照图谱。

2、探讨与分析

结果：从电泳结果来看，血清蛋白1管没有出现电泳图谱，我们小组的试验没有成功。

试验失败及误差分析：

试验失败原因分析1.过DEAE纤维素层析住后收集时，可能收集到其次管前清蛋白已经全部流出或者剩下的量过少，使得电泳结果看不出图谱；2.在放置点样后的醋酸纤维素薄膜时，使点样处可能与电泳槽接触，使得样品与电泳槽黏附，影响电泳。

电泳图谱不明显，试验误差分析1.过D层析柱时收集蛋白质过慢，处于峰值的蛋白质已有部分流出，造成用于电泳的蛋白质浓度较低；2.过DEAE-纤维素层析柱，用磺基水杨酸检测蛋白质均迟迟不出现沉淀便在流出1.5mL后即开始收集，可能收集过早，蛋白质收集不全；3.点样时盖玻片占取的蛋白质溶液过少。

3、思考题a.硫酸铵盐析一步，为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?答：依据的原理：在蛋白质溶液中，参与无机盐至一定浓度，或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分开出来。0.8ml饱和硫酸铵加到0.8ml血清中有利于血清蛋白析出。

b.为什么试验中DEAE纤维素柱分开-球蛋白后不用再生，可直接用于纯化清蛋白?答：当用0.02mol/LNH4Ac，pH6.5分开-球蛋白时，清蛋白及a、b球蛋白的pI＜6.5，带负电荷-球蛋白pI＞6.5，带正电荷；此时清蛋白及a、b球蛋白被层析柱吸附，-球蛋白被洗脱。当用0.06mol/LNH4Ac，pH6.5时，a、b球蛋白被洗脱，清蛋白仍被吸附，只有用到0.3mol/L的NH4Ac时，清蛋白才被洗脱出来。

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