下一代测序技术在临床实验诊断中的应用

下一代测序技术

在临床实验诊断中的应用

测序技术的发展1954年，Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法，Gilbert等发明的化学降解法进行DNA测序80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪90年代中期出现毛细管电泳技术Sanger测序技术指标读长可达1000bp准确率99.999%每千碱基对测序成本仅$0.5每天的数据通量可以达到600000

bp对于一代测序而言，其速度和成本已达到极限。测序技术的发展进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的下一代测序技术诞生了。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——GenomeSequencer20System，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。“Nextgenerationsequencing”PubmedsearchingJun10,2015FortheFirsttime:Whole-GenomeSequencingDeliversNewTreatmentOptionsforTwinswithRareGeneticMovementDisorder50-HourWholeGenomeSequencingProvidesRapidDiagnosisforChildrenWithGeneticDisorders下一代测序（NGS）已逐渐应用于临床分子诊断不同规模的NGS实验在临床分子诊断中的应用全基因组测序（Genome）：产前诊断全外显子组测序（Exome）：发现、鉴定致病基因靶向目标基因测序（Panel）：临床分子诊断SangerPanelExomeGenome非常准确价格低廉/外显子检测周期短可以优化“偶然发现”可能性低容易分析结果容易解读无基因偏倚标准化工作流程可以对用完的数据进行再分析测序无偏倚极少技术偏倚同时检测结构性变异和SNV对遗传异质性高的疾病诊断率低需要对panel进行设计和再设计针对不同的疾病需要不同的panel需要足够的样本存在测序偏倚没有非编码区信息“偶然发现”存在数据分析瓶颈非编码区变异的解释耗时临床分子诊断中各种测序方法的优劣比较Contributionofdifferentfactorstotheoverallcostofasequencingprojectacrosstime在临床诊断领域首次利用WES，对一例原先怀疑为Batter综合征的患儿作出了先天性氯化物丢失性腹泻的正确诊断，该患儿发生了SLC26A3基因的D652N的新生纯合突变NGS在临床分子诊断中的应用NGS在神经肌肉系统疾病分子诊断中的应用(1)将NGS技术作为常规诊断试验进行候选基因突变筛查对于神经肌肉系统疾病患者的临床诊疗和遗传咨询具有重要价值NGS在神经肌肉系统疾病分子诊断中的应用(2)DMD和BMD是最常见的NMDDMD基因巨大，常规方法难度大89例DMD和BMD患者，18例女性携带者和245例非DMD患者CNV：99.99%精确性

和98.96%敏感性SNV：100%准确率9例患者发生部分外显子缺失，可知精确断裂位置信息NGS在视网膜疾病分子诊断中的应用（1）作者病例数基因数临床诊断基因诊断率Neveling,etal.100111视网膜变性36%Audo,etal.20254遗传性视网膜病家系57%Bowne,etal.2146常染色体显性遗传视网膜变性家系24%Glockle,etal.170105遗传性视网膜营养不良55%～80%Wang,etal.123163视网膜变性37%Fu,etal.31163常染色体隐性视网膜变性家系40%较之传统的分子诊断方法（如采用Sanger测序技术逐个基因进行分析），NGS能够有效提高各种类型视网膜疾病分子诊断的能力和效率；同时能有效降低分子诊断的费用NGS在视网膜疾病分子诊断中的应用（2）105个已知视网膜疾病致病基因组成的NGS诊断panel107例临床未经筛选的视网膜疾病患者视网膜变性患者的分子诊断率：55%Bardet–Biedl综合征或Usher综合征患者：80%均发现致病或候选致病变异NGS在遗传病携带者检测中的应用利用NGS技术，能对严重影响儿童健康的遗传病进行全面、系统筛查NGS在线粒体疾病分子诊断中的应用42例经常规基因检测未能诊断的婴儿型线粒体病此panel包含线粒体基因组、100个已知线粒体病致病基因及1000个与线粒体功能相关基因与正常人相比，患者群体中具有功能影响的变异（罕见变异、影响蛋白功能的变异及隐性遗传的变异）负荷增加了5倍55%存在隐性基因突变或致病性线粒体基因突变：10例（24%）患者进行明确的分子诊断；

13例（31%）患者出现核基因突变，其中2例患者的突变经功能研究发现可疑引起线粒体病NGS在产前诊断中的应用利用NGS技术对孕妇外周血中的cfDNA进行无创产前诊断（noninvasiveprenataltesting,NIPT）已成为该领域的发展趋势基于孕妇外周血无细胞血浆胎儿DNA的无创产前诊断的21三体（0.3%vs.3.6%,P<0.001）和18三体（0.2%vs.0.6%,P=0.03）的假阳性率远低于传统的产前筛查NIPT能够检出全部携带常染色体异倍体的孕妇，阴性预测值为100%（95%CI：99.8%～100%）同时，NIPT对21三体（45.5%vs4.2%）和18三体（40.0%vs8.3%）的阳性预测值显著高于标准筛查方法可以作为常染色体异倍体筛查的一线方法NGS在肿瘤分子诊断中的应用诊断用药治疗监测预后评估……精准医学计划2015年1月20日，美国总统奥巴马在国情咨文演讲中提出了“精准医学计划”，30日白宫发布文件正式启动“精准医学计划”，希望精准医学可以引领一个医学新时代。精准医学

是一种在预防和治疗疾病时，考虑到人体在遗传、环境和生活方式中存在个体化差异的新方法。精准医学计划将产出推动精准医学概念进入临床实践的科学证据。美国精准医学计划-定义把按基因匹配癌症疗法变得像匹配血型那样标准化，把找出正确的用药剂量变得像测量体温那样简单，每次都给恰当的人在恰当的时间使用恰当的疗法。美国精准医学计划-定义美国总统奥巴马的解释美国精准医学计划-目标着重发展癌症基因组学支持靶向药物的临床试验、药物组合解决方案以及限制靶向用药耐药性的研究开发新的肿瘤细胞模型以预测药物组合有效性，并研究药物耐药机制短期目标：致力于将精准医学应用于癌症领域针对不同人群的靶向抗肿瘤药物的创新性临床试验癌症的综合疗法攻克药物耐受长期目标：为实现多种疾病的个性化治疗提供有价值的信息创建大于100万的志愿者队列，他们愿意共享基因数据、生物样本及所有电子健康信息。通过分析百万志愿者的基因信息，研究遗传性变异在疾病发生发展中的作用，了解疾病治疗的分子基础，为药物研发与患者“精准治疗”明确方向。高级药物基因组学，针对每个病人使用正确剂量的正确药物确定疾病新的治疗和预防目标测试移动设备对人们健康生活习惯养成的作用为更多疾病的精准医学提供科学基础美国精准医学计划-目标中国的精准医学国家精准医疗战略专家会议组建19人专家委员会计划在2030年前投入600亿元精准医学时代的到来美国精准医学：强调的基因组、蛋白质组学等大多存在于分子层面，并以癌症等重大疾病为主要攻克对象；中国精准医学：定义更加宽泛，现代科技中不局限于分子层面，且加入了其他科技以及传统医学，并把有效与安全、经济，个体和社会效益放在同等重要的地位。中国疾病分布有自身特点：中国癌症患者多，肿瘤患者每年新增350万例，且癌症发病谱有自身特点在遗传病上，每年出生的缺陷新生儿120万例中国是一个传染病大国，抗生素滥用非常突出中国版精准医疗需要聚焦在恶性肿瘤、疑难罕见病、疑难性疾病、药物基因组学。我国应发展具有中国特色、符合中国国情的精准医学中国的精准医学NGS在肿瘤分子诊断中的应用RainDropSourceKRASBackgroundSample+ThunderboltsEGFRTP53ThunderboltcancerpanelIncludeskeydrivermutations,tumorsuppressorgenes,drugresistancemarkersDividesample’stargetsintodigitalsingle-moleculeformatAllthedropletshaveALLtheprimerpairsIndexingbarcodesincorporatedin2ndstandard-formatPCRreactionFlowcell-readyforIlluminasequencersABL1EGFRGNAQKRASPTPN11AKT1ERBB2GNASMETRB1ALKERBB4HNF1AMLH1RETAPCEZH2HRASMPLSMAD4ATMFBXW7IDH1NOTCH1SMARCB1BRAFFGFR1IDH2NPM1SMOCDH1FGFR2JAK2NRASSRCCDKN2AFGFR3JAK3PDGFRASTK11CSF1RFLT3KDRPIK3CATP53CTNNB1GNA11KITPTENVHL50ImportantCancerGenes230AmpliconsOncologyCompanionDx我们的实践WES用于范可尼贫血（FA-A）的

临床分子诊断FANCA基因的复合杂合突变WES用于家族性马蹄内翻足的

临床分子诊断FLNBc.4810G>T,p.D1604YWES用于先天性关节挛缩畸形的

临床分子诊断WES用于出血病患者的分子诊断病人资料患者，女性，临床类似血友病出血表现用凝血酶原复合物治疗有效DIC、凝血因子活性检测均正常VWD排除血小板功能正常其弟与其有相似的临床出血表现，父母为近亲婚配遗传性出血性疾病（凝血因子功能缺陷？）NGS结果631A>C,211T>P

F10基因表型诊断APTT:

50.2sFⅤ:124.9%PT:

11.3sFⅧ:76.7%INR:

0.98FⅪ:118.7%FIB:

3.71g/LFⅫ:80.7%FⅡ:

109.8%FⅦ:

100.4%FⅨ:72.0%FⅩ(PT法):

108.3%FX:C（APTT法）=4.36%病人凝固时间=76.7s发色底物法：FX:C=109.4%NGS应用于疾病基因诊断存在的问题基因变异致病性的确定（缺乏统一、精确注释、经审核的基因型-表型数据库;文献报道中有27%的致病变异实为多态性或注释错误）偶然发现结果的报告（ACMG指南及引发的争议）N