现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法课件

第三章分子荧光光谱法分子荧光光谱法又称为分子荧光分光光度法英文表示：moleculefluorescencespectrum简称MFS

分子荧光分析属于发射光谱第三章分子荧光光谱法分子荧光光谱法又称为分子荧光分光光度1重点部分荧光分析的基本原理荧光和分子结构的关系荧光分析仪的基本类型及分析原理分子荧光分析的应用重点部分荧光分析的基本原理2难点内容荧光产生机理荧光和分子结构的关系难点内容荧光产生机理3基本概念荧光效率荧光猝灭振动驰豫基本概念荧光效率4荧光法具有很强的检出能力，其检出限通常低于吸收光度法2～4个数量级，选择性也比吸收光度法好。许多重要的生化物质，药物和致癌物质（多环芳烃）都能产生荧光，因此荧光分析法在药物分析，临床分析，环境分析及食品分析中占有重要的地位。在无机物分析中，荧光法也有较广泛的应用。荧光属发射光谱范畴。光致发光包括荧光和磷光。发光光谱:物质分子或原子吸收辐射被激发后,电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级,再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光,磷光.荧光法具有很强的检出能力，其检出限通常低于吸收光度法2～4个5第一节

分子发光分析法分子发光分析主要包括:荧光分析磷光分析化学发光分析第一节

分子发光分析法分子发光分析主要包括:6若分子吸收了光能而激发到较高能态，在返回基态时，发射出与吸收波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。光致发光最常见的类型是荧光和磷光。若在化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发,在返回基态时发出光辐射,称为化学发光(chemiluminescence)。若分子吸收了光能而激发到较高能态，在返回基态时，发射出与吸收7荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同，可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区别：对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿命fluorescencelifetime

）。磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同，可从实验观察激发态分8荧光分析法发展简史世界上第一次记录荧光现象是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes。1575年他提出在含有一种木头切片的水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。荧光分析法发展简史世界上第一次记录荧光现象是16世纪西班牙的91852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，从而导入了荧光是光发射的概念。1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作。应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West完成了第一台荧光计。1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光10现代生物仪器分析第三章分子荧光光谱法课件11第二节荧光分析的原理（一）荧光发生机理物质的基态分子受一激发光源的照射，被激发至激发态，在返回基态时，产生波长与入射光相同或较长的荧光。通过测定物质分子产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光分析(fluorescenceanalysis)。第二节荧光分析的原理（一）荧光发生机理通过测定物质分子121、分子的激发态分子在基态时通常具有多对自旋成对的电子，根据包里不相容原理，在一个轨道上运动的两个电子的自旋方向是相反的。配对电子自旋总和是零。激发的单重态：分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子处于激发的单重态(singlestate)。用符号S表示。激发的三重态：如果电子在跃迁过程中自旋方向发生了改变，即两个电子的自旋相互平行，分子处于激发的三重态(tripletstate)。用T表示。1、分子的激发态分子在基态时通常具有多对自旋成对的电子，根据13激发单重态与激发三重态的性质不同荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态单重态分子为反磁性，三重态分子为顺磁性的。激发单重态的平均寿命约为10-8s，而激发三重态的平均寿命长达10-4～10s以上。基态单重态到激发单重态的激发容易发生，基态单重态到激发三重态的几率只相当于前者的10-6。激发单重态与激发三重态的性质不同荧光：10-7～10-9s,14现代生物仪器分析第三章分子荧光光谱法课件152、分子荧光和磷光的产生分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的各个振--转能级。处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条途径。

2、分子荧光和磷光的产生分子在室温时基本上处于电子能级的基态16去活化过程是指分子中处于激发态的电子以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式放出多余能量.去活化过程是指分子中处于激发态的电子以辐射跃迁方式或无辐射跃17振动弛豫

vibrationalrelaxation

在溶液中,处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞,把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子(环境),在10-11~10-13秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级,这一过程称为振动弛豫.因能量不是以光辐射的形式发生，故振动弛豫属无辐射跃迁。振动弛豫只能在同一电子能级内进行，时间为10-12S数量级。振动弛豫

vibrationalrelaxation在溶18（2）内转换（内部能量转换

）

internalconversion

当两个电子激发态之间的能量相差较小，以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射跃迁转移至低电子能级。当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时,分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上,这一无辐射过程称为"内转换".“内转换”过程同样也发生在三重激发态的电子能级间是相同多重度的能态之间的一种无辐射跃迁，跃迁过程中电子的自旋不改变，如Sm~→Sn,Tm~→Tn，时间10-12秒.

（2）内转换（内部能量转换）

internalconve19（3）荧光发射

fluorescenceemission当激发态的分子通过振动驰豫—内转换—振动驰豫到达第一单重激发态的最低振动能级时,第一单重激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射(光子)跃迁回到基态的不同振动能级,这时发射的光量子即为荧光，此过程称为“荧光发射”.

电子振动弛豫和内转换损失了部分能量，荧光的能量小于激发光能量，故发射荧光的波长比激发光波长要长。发射荧光的过程约为10-9～10-7S。（3）荧光发射

fluorescenceemission当20（4）外转换（外部能量转换）

externalconversion

激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用(如碰撞)而以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程称"外转换".外转换常发生在第一激发态单重态或第一激发态三重态的最低振动能级向基态转换的过程中，所需时间也为10-9～10-7S。外转换降低荧光强度。外转换与振动弛豫的异同点：均与粒子间的相互碰撞有关。但振动弛豫只能在同一电子能级内进行，时间10-12S，外转换常发生在第一激发单线态或三线态→基态的过程中，时间10-9～10-7S。

（4）外转换（外部能量转换）

external21（5）系间跨越（体系间跨越）

intersystemcrossing

是指处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。如果激发单重态S1*的最低振动能级同三重态T1*的最高振动能级重叠，则有可能发生电子自旋反转的体系跨越。分子由激发单线态跨越三线态后，荧光强度减弱甚至熄灭。含有重原子如溴、碘等的分子，体系间跨越最为常见，原因是在高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反转的发生。此外在溶液中存在氧分子等顺磁性物质也容易发生体系间跨越，从而使荧光减弱。

指激发单重态与激发三重态之间的无辐射跃迁，它涉及受激电子自旋状态的改变。（5）系间跨越（体系间跨越）

inters22（6）磷光发射

phosphorescenceemission第一电子三重激发态最低振动能级的分子以发射辐射(光子)的形式回到基态的不同振动能级,此过程称为"磷光发射".

(磷光的波长较荧光的波长稍长,发生过程较慢约10-4~10s).由于三线态→单线态的跃迁是禁阻的,三线态寿命比较长(10-3~10s左右),若没其它过程同它竞争时,磷光的发生就有可能;由于三线态寿命较长,因而发生振动弛豫及外转换的几率也高,失去激发能的可能性大,以致在室温条件下很难观察到溶液中的磷光现象.因此,试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到某些分子的磷光.磷光在激发光辐射停止后仍可以持续一段时间。由于激发三线态的最低振动能级能量低，所以磷光辐射的能量比荧光小，亦即磷光的波长与荧光的更长。（6）磷光发射

phosphorescenceem23（二）激发光谱和荧光光谱荧光物质分子都具有2个特征光谱，即激发光谱与荧光光谱。（1）激发光谱excitationspectrum

指不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。具体测绘方法是：固定荧光波长，改变激发波长，测定相应的荧光强度，以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱。从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长,可得到强度最大的荧光.（二）激发光谱和荧光光谱荧光物质分子都具有2个特征光谱，即激24荧光激发光谱可用于鉴别荧光物质及荧光测定时选择适宜的激发光。激发光谱表明不同波长的激发光产生荧光的相对效率。激发光谱中最高峰的波长，能使荧光的物质发出最强的荧光。荧光激发光谱可用于鉴别荧光物质及荧光测定时选择适宜的激发光。25蒽的激发光谱和荧光光谱…表示激发光谱—表示荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱…表示激发光谱—表示荧光光谱26⑵荧光光谱fluorescencespectrum

表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。即固定激发光波长和强度，让物质所发射的荧光通过单色器色散，测定不同波长时荧光强度.具体做法是：固定激发光波长及强度，测定不同荧光波长相应的荧光强度，以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，可得到荧光光谱。

荧光物质的最大激发波长λexmax和最大荧光波长λemmax是鉴定物质的依据。选择ex作激发光源,用另一单色器将物质发射的荧光分光,记录每一波长下的F,作F-光谱图称为荧光光谱.

荧光光谱中荧光强度最强的波长为em.

ex与em一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长.⑵荧光光谱fluorescencespectrum表示27第三节荧光和分子结构的关系分子产生荧光必须具备的2个条件：⑴分子必须具有能吸收一定频率激发光的特定结构；⑵分子在吸收了特征频率的辐射能后，必须具有较高的荧光效率。荧光效率fluorescenceefficiency：物质发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数的比值.第三节荧光和分子结构的关系分子产生荧光必须具备的2个条件28荧光效率表示物质发射荧光的能力：

高荧光物质如荧光素，其值一般接近于1。大多数物质的值一般小于1。如罗丹明B的乙醇溶液＝0.97，蒽的乙醇溶液＝0.30。＝0意味着该物质不能发射荧光。荧光效率表示物质发射荧光的能力：291、具有共轭双键结构的有机物对于大多数荧光物质来说，都是经历π→π*或n→π*跃迁而得到荧光。其中以π→π*跃迁发出的荧光较强。同时随着体系共轭度的增加，荧光效率一般也随之增大。1、具有共轭双键结构的有机物30一般而言，芳香族化合物分子或含有多共轭双键的分子是荧光性的。而能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少。一般而言，芳香族化合物分子或含有多共轭双键的分子是荧光性的。312、具有刚性平面结构的分子具有刚性的不饱和的平面结构的有机分子具有强烈的荧光。分子的刚性及共平面性越大，荧光效率越高。2、具有刚性平面结构的分子32例如荧光素和酚酞：例如荧光素和酚酞：333、苯环上取代基的类型通常有以下一些规律：（1）给电子基团常使荧光增强，如—OH、—NH2、—NHR、—NR2，—OR等；（2）同π电子体系相互作用较小的取代基如—SO3H、—NH3+和烷基对分子荧光的影响不明显；（3）吸电子基团如—COOH、—C=O、—NO2、—NO、—N=N—及卤素会减弱甚至破坏荧光。3、苯环上取代基的类型34第四节影响荧光强度的因素1、温度的影响

温度降低荧光强度增强，相反温度上升会使荧光强度下降。主要原因：溶液温度下降时溶液中分子的活性减弱，溶剂粘度增大，溶质分子与溶剂分子之间碰撞机会减少，降低了无辐射去活几率，使荧光效率增加。相反随着温度上升，碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。第四节影响荧光强度的因素1、温度的影响主要原因：35例如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光效率增加3%；冷至－80℃时，荧光效率为100%。例如荧光素的乙醇溶液362、溶剂的影响

同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显不同。一般情况下，随着溶剂极性的增强，荧光物质的n→π*跃迁能量将增大，π→π*跃迁能量将减少，从而导致荧光强度增强，荧光峰红移。维生素B6：在二噁烷中荧光波长为335nm；在水中荧光波长为400nm2、溶剂的影响维生素B6：37

3、溶液PH值的影响当荧光物质是弱酸或弱碱时，溶液的PH值对其荧光强度和荧光光谱影响较大。有些荧光物质在离子状态无荧光，而有些则相反；有些荧光物质在分子和离子状态时都有荧光，但荧光光谱却不同。3、溶液PH值的影响38以苯胺为例：在PH7~12的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光；而在PH＜2或PH＞13的溶液中苯胺以离子形式存在，都不发生荧光。以苯胺为例：39

4、猝灭剂的影响

荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低或消失的现象称为荧光猝灭fluorescencequenching

。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等均为常见的猝灭剂。4、猝灭剂的影响40引起溶液中荧光猝灭的主要原因有：（1）碰撞猝灭是指处于单重激发态的荧光分子与猝灭剂发生碰撞，使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态，因而产生猝灭作用。引起溶液中荧光猝灭的主要原因有：41（2）氧的猝灭溶解氧的存在使荧光物质氧化，或由于顺磁性的氧分子与单重激发态的荧光分子相作用生成顺磁性的三重态而使荧光猝灭。（2）氧的猝灭42

（3）静态猝灭静态猝灭又称组合化合物的猝灭。荧光物质分子与猝灭剂分子作用生成非荧光的配合物。（3）静态猝灭43

（4）重原子效应荧光物质分子中引入溴或碘，使系间跨越增加，易使单重态转化为三重态。（4）重原子效应44（5）自猝灭和自吸收当荧光物质浓度较大时，常会发生自猝灭现象。其原因是：单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起自猝灭。如蒽和苯的自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。（5）自猝灭和自吸收45当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱曲线重叠时，荧光被溶液中处于基态的分子吸收。这种现象称为自吸收。当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱曲线重叠时，荧光被溶液中处46第四节荧光分析仪荧光分析的仪器有：荧光计和荧光分光光度计两大类。它们通常都是由激发光源、单色器、样品池、检测器以及放大显示系统组成。第四节荧光分析仪荧光分析的仪器有：47荧光分光光度计荧光分光光度计48荧光分析仪组成示意图

荧光分析仪组成示意图491、激发光源常用的光源有高压汞灯、氙灯。高压汞灯发射的光强度大而稳定，但光谱不连续，荧光分析中常用365、405、436nm三条谱线，常用于荧光计.平均寿命为1500～3000h。1、激发光源常用的光源有高压汞灯、氙灯。50氙灯发射的光强度大，能在紫外及可见区给出较好的连续光谱，可用于200～700nm波长范围，在300～400nm波段内，光谱强度几乎相等。氙灯常用于荧光分光光度计。氙灯发射的光强度大，能在紫外及可见区给出较好的连续光谱，可用512、样品池荧光分析用的样品池需用低荧光材料，常用石英池，四面都是抛光的，有的附有恒温装置。2、样品池52现代生物仪器分析第三章分子荧光光谱法课件53

3、单色器荧光计用滤光片作单色器，滤光片分激发光用滤光片和荧光用滤光片。荧光分光光度计则采用两块光栅作为单色器，一块用于选择激发光，另一块用于荧光的色散。3、单色器544、检测器荧光的强度通常比较弱，因此要求检测器具有较高的灵敏度。在荧光计中常用光电池或光电管；在荧光分光光度计中常用光电倍增管。4、检测器荧光的强度通常比较弱，因此要求检测器具有较高的灵敏55第五节分子荧光分析法及其应用1、定性分析在使用荧光分析法进行定性时，一般常需用纯品作对照。在定性时应测绘荧光物质与纯品的激发光谱和荧光光谱，若纯品与被测样品的激发光谱和荧光光谱一致，可认为为同一荧光物质。分子荧光定性分析应用比较少。第五节分子荧光分析法及其应用1、定性分析56

2、定量分析（1）标准曲线法荧光分析一般多采用标准曲线法。即用已知量的标准物质经过和试样一样的处理后，配成不同浓度的标准溶液，在一定的仪器条件下测定这些标准溶液的荧光强度，以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。然后在同样的仪器条件下，测定试样溶液的荧光强度，然后从标准曲线上查出该试样溶液的浓度。2、定量分析（1）标准曲线法即用已知量的标准物质经过和试样57（2）比较法如果已知某荧光物质标准曲线的浓度线性范围。在此浓度范围内配一标准溶液，测定其荧光强度；然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度（荧光强度不应超过标准曲线范围）；由标准溶液的浓度以及试样溶液与标准溶液荧光强度的比值，求得试样中荧光物质的含量。（2）比较法如果已知某荧光物质标准曲线的浓度线性范围。583、应用定量分析方法一般有以下几种：对于自身能发生荧光的化合物，可直接测定；对于发射荧光较弱或不能发射荧光的物质，可利用有机试剂与其形成能发生荧光的配合物来进行测定；有些荧光物质能与猝灭剂作用而导致溶液荧光强度的降低，可由测量其荧光强度降低的程度来测定其含量。3、应用定量分析方法一般有以下几种：59（1）元素的荧光测定在紫外光照射下能发生荧光的无机物很少，对于无机阳离子的测定，是利用无机阳离子能与一些有机试剂形成荧光配合物，然后进行荧光测定。（1）元素的荧光测定在紫外光照射下能发生荧光的无机物很少，对60能用此方法进行分析的元素已达60余种。其中铍、铝、硼、镓、硒、镁以及某些稀土元素，常用荧光法进行测定。一些阴离子，如氟、氰等离子能使荧光减弱，可用荧光猝灭法测定。可用荧光猝灭法测定的元素有氟、硫、氰离子、铁、银、钴、镍等。能用此方法进行分析的元素已达60余种。61（2）有机化合物芳香族化合物具有共轭不饱和结构，多能产生荧光，可以直接进行荧光测定。此外可用荧光法测定氨基酸、蛋白质。荧光法也是进行定性和定量分析酶以及研究酶动力学和机理的有用工具。在医学和药学方面，荧光法是测定肾上腺素、维生素、抗菌素等药物的灵敏方法。（2）有机化合物芳香族化合物具有共轭不饱和结构，多能产生荧光62荧光分光光度计（天津）荧光分光光度计（天津）63荧光分光光度计（日本）荧光分光光度计（日本）64荧光分光光度计（日本）荧光分光光度计（日本）65荧光分光光度计（日本）荧光分光光度计（日本）66现代生物仪器分析第三章分子荧光光谱法课件67第三章分子荧光光谱法分子荧光光谱法又称为分子荧光分光光度法英文表示：moleculefluorescencespectrum简称MFS

分子荧光分析属于发射光谱第三章分子荧光光谱法分子荧光光谱法又称为分子荧光分光光度68重点部分荧光分析的基本原理荧光和分子结构的关系荧光分析仪的基本类型及分析原理分子荧光分析的应用重点部分荧光分析的基本原理69难点内容荧光产生机理荧光和分子结构的关系难点内容荧光产生机理70基本概念荧光效率荧光猝灭振动驰豫基本概念荧光效率71荧光法具有很强的检出能力，其检出限通常低于吸收光度法2～4个数量级，选择性也比吸收光度法好。许多重要的生化物质，药物和致癌物质（多环芳烃）都能产生荧光，因此荧光分析法在药物分析，临床分析，环境分析及食品分析中占有重要的地位。在无机物分析中，荧光法也有较广泛的应用。荧光属发射光谱范畴。光致发光包括荧光和磷光。发光光谱:物质分子或原子吸收辐射被激发后,电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级,再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光,磷光.荧光法具有很强的检出能力，其检出限通常低于吸收光度法2～4个72第一节

分子发光分析法分子发光分析主要包括:荧光分析磷光分析化学发光分析第一节

分子发光分析法分子发光分析主要包括:73若分子吸收了光能而激发到较高能态，在返回基态时，发射出与吸收波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。光致发光最常见的类型是荧光和磷光。若在化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发,在返回基态时发出光辐射,称为化学发光(chemiluminescence)。若分子吸收了光能而激发到较高能态，在返回基态时，发射出与吸收74荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同，可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区别：对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿命fluorescencelifetime

）。磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同，可从实验观察激发态分75荧光分析法发展简史世界上第一次记录荧光现象是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes。1575年他提出在含有一种木头切片的水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。荧光分析法发展简史世界上第一次记录荧光现象是16世纪西班牙的761852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，从而导入了荧光是光发射的概念。1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作。应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West完成了第一台荧光计。1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光77现代生物仪器分析第三章分子荧光光谱法课件78第二节荧光分析的原理（一）荧光发生机理物质的基态分子受一激发光源的照射，被激发至激发态，在返回基态时，产生波长与入射光相同或较长的荧光。通过测定物质分子产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光分析(fluorescenceanalysis)。第二节荧光分析的原理（一）荧光发生机理通过测定物质分子791、分子的激发态分子在基态时通常具有多对自旋成对的电子，根据包里不相容原理，在一个轨道上运动的两个电子的自旋方向是相反的。配对电子自旋总和是零。激发的单重态：分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子处于激发的单重态(singlestate)。用符号S表示。激发的三重态：如果电子在跃迁过程中自旋方向发生了改变，即两个电子的自旋相互平行，分子处于激发的三重态(tripletstate)。用T表示。1、分子的激发态分子在基态时通常具有多对自旋成对的电子，根据80激发单重态与激发三重态的性质不同荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态单重态分子为反磁性，三重态分子为顺磁性的。激发单重态的平均寿命约为10-8s，而激发三重态的平均寿命长达10-4～10s以上。基态单重态到激发单重态的激发容易发生，基态单重态到激发三重态的几率只相当于前者的10-6。激发单重态与激发三重态的性质不同荧光：10-7～10-9s,81现代生物仪器分析第三章分子荧光光谱法课件822、分子荧光和磷光的产生分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的各个振--转能级。处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条途径。

2、分子荧光和磷光的产生分子在室温时基本上处于电子能级的基态83去活化过程是指分子中处于激发态的电子以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式放出多余能量.去活化过程是指分子中处于激发态的电子以辐射跃迁方式或无辐射跃84振动弛豫

vibrationalrelaxation

在溶液中,处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞,把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子(环境),在10-11~10-13秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级,这一过程称为振动弛豫.因能量不是以光辐射的形式发生，故振动弛豫属无辐射跃迁。振动弛豫只能在同一电子能级内进行，时间为10-12S数量级。振动弛豫

vibrationalrelaxation在溶85（2）内转换（内部能量转换

）

internalconversion

当两个电子激发态之间的能量相差较小，以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射跃迁转移至低电子能级。当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时,分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上,这一无辐射过程称为"内转换".“内转换”过程同样也发生在三重激发态的电子能级间是相同多重度的能态之间的一种无辐射跃迁，跃迁过程中电子的自旋不改变，如Sm~→Sn,Tm~→Tn，时间10-12秒.

（2）内转换（内部能量转换）

internalconve86（3）荧光发射

fluorescenceemission当激发态的分子通过振动驰豫—内转换—振动驰豫到达第一单重激发态的最低振动能级时,第一单重激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射(光子)跃迁回到基态的不同振动能级,这时发射的光量子即为荧光，此过程称为“荧光发射”.

电子振动弛豫和内转换损失了部分能量，荧光的能量小于激发光能量，故发射荧光的波长比激发光波长要长。发射荧光的过程约为10-9～10-7S。（3）荧光发射

fluorescenceemission当87（4）外转换（外部能量转换）

externalconversion

激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用(如碰撞)而以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程称"外转换".外转换常发生在第一激发态单重态或第一激发态三重态的最低振动能级向基态转换的过程中，所需时间也为10-9～10-7S。外转换降低荧光强度。外转换与振动弛豫的异同点：均与粒子间的相互碰撞有关。但振动弛豫只能在同一电子能级内进行，时间10-12S，外转换常发生在第一激发单线态或三线态→基态的过程中，时间10-9～10-7S。

（4）外转换（外部能量转换）

external88（5）系间跨越（体系间跨越）

intersystemcrossing

是指处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。如果激发单重态S1*的最低振动能级同三重态T1*的最高振动能级重叠，则有可能发生电子自旋反转的体系跨越。分子由激发单线态跨越三线态后，荧光强度减弱甚至熄灭。含有重原子如溴、碘等的分子，体系间跨越最为常见，原因是在高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反转的发生。此外在溶液中存在氧分子等顺磁性物质也容易发生体系间跨越，从而使荧光减弱。

指激发单重态与激发三重态之间的无辐射跃迁，它涉及受激电子自旋状态的改变。（5）系间跨越（体系间跨越）

inters89（6）磷光发射

phosphorescenceemission第一电子三重激发态最低振动能级的分子以发射辐射(光子)的形式回到基态的不同振动能级,此过程称为"磷光发射".

(磷光的波长较荧光的波长稍长,发生过程较慢约10-4~10s).由于三线态→单线态的跃迁是禁阻的,三线态寿命比较长(10-3~10s左右),若没其它过程同它竞争时,磷光的发生就有可能;由于三线态寿命较长,因而发生振动弛豫及外转换的几率也高,失去激发能的可能性大,以致在室温条件下很难观察到溶液中的磷光现象.因此,试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到某些分子的磷光.磷光在激发光辐射停止后仍可以持续一段时间。由于激发三线态的最低振动能级能量低，所以磷光辐射的能量比荧光小，亦即磷光的波长与荧光的更长。（6）磷光发射

phosphorescenceem90（二）激发光谱和荧光光谱荧光物质分子都具有2个特征光谱，即激发光谱与荧光光谱。（1）激发光谱excitationspectrum

指不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。具体测绘方法是：固定荧光波长，改变激发波长，测定相应的荧光强度，以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱。从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长,可得到强度最大的荧光.（二）激发光谱和荧光光谱荧光物质分子都具有2个特征光谱，即激91荧光激发光谱可用于鉴别荧光物质及荧光测定时选择适宜的激发光。激发光谱表明不同波长的激发光产生荧光的相对效率。激发光谱中最高峰的波长，能使荧光的物质发出最强的荧光。荧光激发光谱可用于鉴别荧光物质及荧光测定时选择适宜的激发光。92蒽的激发光谱和荧光光谱…表示激发光谱—表示荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱…表示激发光谱—表示荧光光谱93⑵荧光光谱fluorescencespectrum

表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。即固定激发光波长和强度，让物质所发射的荧光通过单色器色散，测定不同波长时荧光强度.具体做法是：固定激发光波长及强度，测定不同荧光波长相应的荧光强度，以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，可得到荧光光谱。

荧光物质的最大激发波长λexmax和最大荧光波长λemmax是鉴定物质的依据。选择ex作激发光源,用另一单色器将物质发射的荧光分光,记录每一波长下的F,作F-光谱图称为荧光光谱.

荧光光谱中荧光强度最强的波长为em.

ex与em一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长.⑵荧光光谱fluorescencespectrum表示94第三节荧光和分子结构的关系分子产生荧光必须具备的2个条件：⑴分子必须具有能吸收一定频率激发光的特定结构；⑵分子在吸收了特征频率的辐射能后，必须具有较高的荧光效率。荧光效率fluorescenceefficiency：物质发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数的比值.第三节荧光和分子结构的关系分子产生荧光必须具备的2个条件95荧光效率表示物质发射荧光的能力：

高荧光物质如荧光素，其值一般接近于1。大多数物质的值一般小于1。如罗丹明B的乙醇溶液＝0.97，蒽的乙醇溶液＝0.30。＝0意味着该物质不能发射荧光。荧光效率表示物质发射荧光的能力：961、具有共轭双键结构的有机物对于大多数荧光物质来说，都是经历π→π*或n→π*跃迁而得到荧光。其中以π→π*跃迁发出的荧光较强。同时随着体系共轭度的增加，荧光效率一般也随之增大。1、具有共轭双键结构的有机物97一般而言，芳香族化合物分子或含有多共轭双键的分子是荧光性的。而能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少。一般而言，芳香族化合物分子或含有多共轭双键的分子是荧光性的。982、具有刚性平面结构的分子具有刚性的不饱和的平面结构的有机分子具有强烈的荧光。分子的刚性及共平面性越大，荧光效率越高。2、具有刚性平面结构的分子99例如荧光素和酚酞：例如荧光素和酚酞：1003、苯环上取代基的类型通常有以下一些规律：（1）给电子基团常使荧光增强，如—OH、—NH2、—NHR、—NR2，—OR等；（2）同π电子体系相互作用较小的取代基如—SO3H、—NH3+和烷基对分子荧光的影响不明显；（3）吸电子基团如—COOH、—C=O、—NO2、—NO、—N=N—及卤素会减弱甚至破坏荧光。3、苯环上取代基的类型101第四节影响荧光强度的因素1、温度的影响

温度降低荧光强度增强，相反温度上升会使荧光强度下降。主要原因：溶液温度下降时溶液中分子的活性减弱，溶剂粘度增大，溶质分子与溶剂分子之间碰撞机会减少，降低了无辐射去活几率，使荧光效率增加。相反随着温度上升，碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。第四节影响荧光强度的因素1、温度的影响主要原因：102例如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光效率增加3%；冷至－80℃时，荧光效率为100%。例如荧光素的乙醇溶液1032、溶剂的影响

同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显不同。一般情况下，随着溶剂极性的增强，荧光物质的n→π*跃迁能量将增大，π→π*跃迁能量将减少，从而导致荧光强度增强，荧光峰红移。维生素B6：在二噁烷中荧光波长为335nm；在水中荧光波长为400nm2、溶剂的影响维生素B6：104

3、溶液PH值的影响当荧光物质是弱酸或弱碱时，溶液的PH值对其荧光强度和荧光光谱影响较大。有些荧光物质在离子状态无荧光，而有些则相反；有些荧光物质在分子和离子状态时都有荧光，但荧光光谱却不同。3、溶液PH值的影响105以苯胺为例：在PH7~12的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光；而在PH＜2或PH＞13的溶液中苯胺以离子形式存在，都不发生荧光。以苯胺为例：106

4、猝灭剂的影响

荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低或消失的现象称为荧光猝灭fluorescencequenching

。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等均为常见的猝灭剂。4、猝灭剂的影响107引起溶液中荧光猝灭的主要原因有：（1）碰撞猝灭是指处于单重激发态的荧光分子与猝灭剂发生碰撞，使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态，因而产生猝灭作用。引起溶液中荧光猝灭的主要原因有：108（2）氧的猝灭溶解氧的存在使荧光物质氧化，或由于顺磁性的氧分子与单重激发态的荧光分子相作用生成顺磁性的三重态而使荧光猝灭。（2）氧的猝灭109

（3）静态猝灭静态猝灭又称组合化合物的猝灭。荧光物质分子与猝灭剂分子作用生成非荧光的配合物。（3）静态猝灭110

（4）重原子效应荧光物质分子中引入溴或碘，使系间跨越增加，易使单重态转化为三重态。（4）重原子效应111（5）自猝灭和自吸收当荧光物质浓度较大时，常会发生自猝灭现象。其原因是：单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起自猝灭。如蒽和苯的自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。（5）自猝灭和自吸收112当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱曲线重叠时，荧光被溶液中处于基态的分子吸收。这种现象称为自吸收。当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱曲线重叠时，荧光被溶液中处113第四节荧光分析仪荧光分析的仪器有：荧光计和荧光分光光度计两大类。它们通常都是由激发光源、单色器、样品池、检测器以及放大显示系统组成。第四节荧光分析仪荧光分析的仪器有