肝癌早诊代谢组学研究进展

肝癌早诊代谢组学研究进展我国尚未在肝癌高危人群中普及肝癌早筛工作，且受限于当前肝癌早诊手段，我国肝癌早诊率不足30%。目前临床应用的传统肝癌标志物在诊断方面还缺乏满意的敏感性和特异性，因此，迫切需要寻找更可靠、更准确的肿瘤标志物以进一步提高在高危人群中发现早期肝癌的机会。代谢组学作为多组学中的一个分支，是利用高通量技术对生命系统中相对分子质量<1000×103的小分子代谢产物如氨基酸、核苷酸、糖类和脂质等进行定性和定量分析的系统研究。代谢组学通常使用基于核磁共振、液质联用和气质联用等的技术方法，不仅可识别复杂的代谢表型，还可以整合生物信息学数据和其他组学策略如基因组学、转录组学和蛋白质组学，以阐明疾病潜在的生物学机制并发现疾病风险的临床相关诊断和预后标志物。代谢组学的时间响应在所有组学中最快，且结果易于理解，容易与表型和功能结合，已广泛应用于疾病诊断、治疗监测和药效学评价领域。本文通过对代谢组学研究的新进展进行论述，旨在梳理并探讨基于代谢组学的血清标志物在肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）中的研究现状和前景。一、基于代谢组学的新型HCC血清标志物及模型肝脏是人体新陈代谢的中心站，承担营养物质代谢的主要功能。既往研究报道，代谢重编程已成为肝癌发生时的显著特征。与肝硬化患者和健康对照相比，HCC患者更易观察到葡萄糖、磷脂、游离脂肪酸和胆汁酸等多种代谢紊乱现象。因此，各个途径的代谢标志物均具有反映和预测HCC发生及预后的潜力。1.氨基酸：支链氨基酸（branched-chainaminoacid，BCAA）具有改善胰岛素抵抗，抑制肝细胞血管生成、迁移和上皮间质转化，从而抑制肝癌发生发展的作用。而HCC患者中多观察到血清中BCAA水平降低。既往研究多把该现象归因于BCAA摄入不足或BCAA分解代谢增强。2019年Ericksen等的一项研究则提出HCC发生时，BCAA分解代谢受到抑制，增加的BCAA在肝内聚积，使得其血清浓度降低。相反的是，芳香族氨基酸（aromaticaminoacids，AAA）分解降低致血清水平升高。Jee等通过比较75例转移癌患者和134例匹配年龄和性别的未转移癌患者的基线血清样本（随访期平均7年），发现转移癌患者具有更高水平的亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。其中，高水平亮氨酸可能与HCC发生时BCAA先合成后分解增加的先后顺序有关。与该结果相似，Gong等发现HCC患者中的苯丙氨酸水平明显高于乙型肝炎肝硬化组和健康对照组，具有诊断HCC的强大潜力。与健康对照相比，较高水平的色氨酸也在肝癌患者的门静脉血中被发现。同时，多项代谢组学研究均发现酪氨酸与HCC风险呈正相关且是总生存期的预测因子。更有研究结果显示，AAA的衍生代谢物如5-甲氧基色氨酸（色氨酸衍生物）和苯丙氨酰-色氨酸（由苯丙氨酸和色氨酸残基形成的二肽）也与HCC鉴别或预后相关。综上所述，BCAA和AAA，尤其是AAA，极具有预测和诊断HCC的潜力。尿素循环涉及精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸，以将氨转化为尿素形式而排出体外为目的。其中，高水平的鸟氨酸在韩国一项横断面研究中被证实有利于正确鉴别早期HCC与肝硬化和健康对照。低水平的鸟氨酸则被发现有利于识别HCC合并胆管癌栓，适用于HCC患者预后监测。Bai等发现HCC患者的血清尿素指标明显高于健康对照组和其他肝病患者，且将甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）与尿素和癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）联合后可以显著提高肝癌的早期诊断性能。此外，肺癌、乳腺癌和结直肠癌患者的血清尿素水平也显著升高。这表明尿素也可作为潜在的HCC血清生物标志物，用于区分HCC与其他肝脏疾病。近年有研究表明，甲硫氨酸已成为肝癌诊断和预测的候选标志物。在一项由227例肝硬化患者参与的为期3年的前瞻性随访研究中，甲硫氨酸经过年龄、性别、基线肝性脑病状况和碱性磷酸酶校正后的肝癌风险比最高（HR=9.97，95%CI=3.02～32.94），甲硫氨酸亚砜（由甲硫氨酸生物合成，HR=5.60，95%CI=1.84～17.10）则次于甲硫氨酸，表明甲硫氨酸和甲硫氨酸亚砜可用来预测肝硬化高危人群中HCC的发生。另有研究显示，组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、脯氨酸和哌可酸均可用于诊断HCC。天冬氨酸和谷氨酸则是HCC鉴别诊断和复发监测的有效标志物。2.脂质：（1）胆汁酸类：近年来，大量研究表明胆汁酸类物质与HCC的发生发展有着密切关联，胆汁酸的堆积将导致肝细胞的持续损伤，继而引发肝纤维化和肝癌。既往研究表明多种胆汁酸如牛磺鹅去氧胆酸（taurochenodeoxycholicacid，TCDCA）、脱氧胆酸（deoxycholicacid，DCA）和石胆酸（lithocholicacid，LCA）的蓄积可明显促进人正常肝细胞中的癌蛋白c-Myc的表达，而TCDCA在肝癌细胞中还能明显降低抑癌蛋白CEBPa的表达。本文综述的许多代谢组学文献也证实了，相比对照组（健康对照、肝炎、肝硬化），HCC患者血清中胆汁酸水平有显著差异，同时胆汁酸水平的变化对HCC的早期诊断、评估疾病进展和预后有着重要作用。韩国一项前瞻性研究对75例发生HCC的受试者和134例年龄和性别匹配的无癌受试者的血清样本进行代谢组学研究，发现HCC患者的血清牛磺熊去氧胆酸（tauroursodeoxycholicacid，TUDCA）水平显著升高，TUDCA被认为是与肝癌发病率相关的独立因素。而中国科学院大连化学物理研究所许国旺团队在中国进行的一项多中心研究发现，与健康对照相比，多种胆汁酸如甘胆酸（glycocholicacid，GCA）、牛磺胆酸（taurocholicacid，TCA）、TCDCA、牛磺去氧胆酸（taurodeoxycholicacid，TDCA）等均显著上升，进而发现GCA与苯丙氨酰-色氨酸组成的标志物组合可以早期检测高危人群中的肝癌。另外多项研究也表明GCA的血清水平与肝癌的发生风险呈正相关，且与肝功能受损和生存不良有关，血清甘鹅去氧胆酸（glycochenodeoxycholicacid，GCDCA）和TCA水平也与肝癌的发生风险增加相关，提示其可预测未来肝细胞癌的发展。Barefoot等和Han等研究发现血清代谢物DCA和鹅去氧胆酸（chenodeoxycholicacid，CDCA）可作为区分HCC和肝硬化的潜在生物标志物。Pan等证实血清TDCA水平随着慢性乙型肝炎、肝硬化和HCC的进展而升高，提示其对肝脏疾病进展有诊断作用。Nenu等发现12-酮脱氧胆酸是区分代偿性肝硬化和早期HCC的显著标志物。综上所述，胆汁酸类物质具有较大的潜力可作为HCC的潜在诊断标志物。（2）脂肪酸类：HCC的发生会伴随血液脂肪酸的变化，且少数脂肪酸可用于HCC早期检测。Liu等发现相对于健康对照组，HCC患者门静脉血液中的亚油酸水平更低。且作为人体必需脂肪酸之一，亚油酸可抑制HCC细胞增殖和促进其凋亡，是一个潜在的保护性抗HCC标志物。据报道，花生四烯酸，可通过亚油酸合成，在HCC患者血清中水平增加。而且，花生四烯酸可能通过参与内皮细胞迁移，并转变为前列腺素、白三烯和血栓素等一系列重要的促炎介质，增强肝脏炎症反应，促进HCC的发生发展，进一步增加其作为HCC相关标志物的可能性。除必需脂肪酸和其衍生代谢物外，其他脂肪酸也被陆续报道可作为HCC标志物进一步研究。通过对103例肝硬化患者进行HCC早期监测，Khan等发现在原有模型（骨桥蛋白和AFP）的基础上增加花生酸（20∶0）和n-3-二十二碳五烯酸（22∶5n3）这两种脂肪酸可使得HCC早期诊断模型曲线下面积（areaunderthecurve，AUC）由0.77提高至0.83。另有研究报道，HCC患者的5-羟基己酸（一种脂肪酸的正常二羧酸降解产物）和2-羟基-3-甲基丁酸水平较健康对照组更高，是HCC发病率的独立相关危险因素。Zhang等和Pan等分别发现HCC患者中异油酸和5-羟基6E，8Z，11Z，14Z，17Z-二十碳五烯酸水平较肝硬化患者相比均更低，且前者在HCC进展晚期进一步降低，后者与乙型肝炎患者相比也处于更低水平，提示它们在鉴别HCC方面的潜在用途。（3）磷脂与溶血磷脂类：磷脂不仅是细胞膜的重要组成成分，也在体内细胞信号传递中发挥重要作用。不同于甘油磷酸胆碱水平在HCC患者中的降低，鞘氨醇、1，2-二酰基-3-β-D-半乳糖基-sn-甘油和鞘氨醇（D18：1）-1-P水平均增高。这些代谢物均与磷脂代谢相关，其表达高低的不同进一步体现HCC代谢紊乱，提示它们可能具有鉴别HCC的能力。在西班牙一项早期鉴别肝内胆管癌和HCC的研究中，卵磷脂（34∶3）可用于区别肝内胆管癌和原发性肝癌，而鞘磷脂（42∶3）和鞘磷脂（43∶2）则具有良好的鉴别HCC和肝内胆管癌能力。溶血磷脂是机体内磷脂的正常代谢产物，少数被报道可作为HCC相关标志物。Zhang等发现一个由6种代谢物组成的可用于区分肝硬化和不同分期HCC的模型，其中3个代谢物均属于溶血磷脂类，即溶血卵磷脂[18∶2（9Z，12Z）]、溶血卵磷脂（P-16∶0）和溶血卵磷脂[20∶5（5Z，8Z，11Z，14Z，17Z）]。此外，高水平的溶血卵磷脂（21∶4）和溶血脑磷脂（22∶2）以及低水平的溶血卵磷脂（20∶5）在HCC患者中被发现，可用于肝硬化人群中的HCC诊断。（4）其他脂质类：脂质代谢物种类繁多，功能复杂，除上述胆汁酸、脂肪酸、磷脂和溶血磷脂类别外，还包括固醇、类固醇与类花生酸等。硫酸脱氢表雄酮作为血液循环中的主要雄性激素，与HCC发生呈负相关（OR=0.35，95%CI：0.22～0.57），并可与其他代谢物组合后良好区分HCC患者和健康对照组。这与男性HCC发病率高是由于雄激素的促HCC作用的假说相反，但不排除这可能与肝硬化所致的激素失衡有关。因此，雄激素可被视作HCC标志物，但其与HCC的具体关系和具体作用仍有待证实。Gong等发现4个代表性的类花生酸（花生四烯酸的衍生物：前列腺素F2α，血浆血栓烷B2，5-羟二十碳四烯酸和15-羟二十碳四烯酸）在HCC患者中较乙型肝炎肝硬化患者表达更高，与之前所述花生四烯酸水平在HCC患者中增加一致。据报道，HCC患者中表达升高的1，25-二羟基胆固醇、25-羟基维生素D2、肉豆蔻酯棕榈酸酯和表达降低的辛酰肉碱和吡甲酰肉碱可被视作诊断标志物，应用于肝硬化人群。不同于上述代谢物的诊断作用，高水平肌醇与HCC患者的较高总体生存率相关，具有作为HCC预后监测标志物的作用。另有研究报道，二氢皮质醇可用于区分HCC的TNM分期。3.核苷类：与健康个体或肝硬化患者相比，已发现HCC患者血清中核苷类代谢物的水平显著升高。Stepien等研究发现7-甲基鸟嘌呤（OR=6.78，95%CI：3.24～14.18）与HCC风险呈正相关，它是暴露于甲基化的指标，可能是与吸烟相关的代谢产物。Han等研究显示，血清琥珀酸腺苷（AUC=0.851）和尿苷（AUC=0.769）水平可以很好地区分HCC和非HCC，且优于AFP（AUC=0.706）。另一项研究表明羟基嘌呤在HCC患者血清中的水平显著高于肝硬化患者和健康人。此类代谢物在HCC中的增加可能反映了肿瘤坏死，由于肿瘤组织中释放核酸，其随后在坏死条件下代谢成为羟基嘌呤。4.维生素类：一项同时在组织和血清中进行的代谢组学研究发现，视黄醇区分HCC和非HCC的效能最佳（ACU=0.991），且与Edmondson等级相关。进一步研究视黄醇代谢途径中的相关代谢物发现，从正常到肝硬化到EdmondsonⅠ级到Ⅳ级，肿瘤组织和血清中视黄醇和视黄醛的水平中表现出相同的下降趋势，均按顺序依次降低，且水平更低者的预后更差。提示二者可能是有用的肝癌诊断和预后的生物标志物，具有较高的诊断和预测能力。Stepien等也报道了类似的结果。Liu等发现，与健康对照相比，肝癌患者的门静脉血中含有更高水平的1-甲基烟酰胺，其与肝功能受损和生存率更低相关。5.其他：糖、能量和肽代谢途径在HCC发生过程中也发生了明显改变。据文献报道，柠檬酸盐、亮氨酰脯氨酸等具有较强的区分和诊断HCC与健康对照和肝硬化患者的潜力。半乳糖则与HCC的复发、转移和死亡相关。少数其他类型的代谢物也被报道与HCC的发生发展相关，例如对羟基苯乳酸、DL-3-苯基乳酸和靛红与HCC的风险呈正相关，γ-羧乙基羟基铬酸盐与HCC的风险呈负相关。HCC患者门静脉和粪便中的苯酚水平低于健康对照组。苯酚显著抑制肝癌细胞的增殖，推测其作为保护性代谢产物具有抗肝癌作用。二甲胺、甲酸盐、甘草酸等也对HCC的诊断及分期有潜在帮助。6.基于血清代谢组学的肝癌诊断模型的构建：在筛选得到差异代谢物的基础上，通常会以多种方法构建模型用于HCC的诊断、预测和预后。在上述HCC相关代谢组学研究中，近半数研究基于获得的代谢标志物尝试建立了诊断或预测HCC的模型，多数模型在预测、诊断、评估HCC复发及预后方面有着良好的性能且优于传统的AFP。Kim等应用甲硫氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、吡甲酰肉碱、辛酰肉碱建立的HCC预测模型效能明显优于AFP（AUC：0.82对比0.75），在测试集中差异更显著（AUC：0.94对比0.78）。使用苯丙氨酰-色氨酸和甘胆酸的血清代谢物组合可以很好地从肝硬化高危人群中诊断或预测HCC的发生，其在发现集、验证集和测试集中的AUC可达0.930、0.892和0.807。在巢式病例对照分析中其灵敏度可达70.3%～80.0%，如与AFP结合可以更好地预测HCC。此外该代谢物组合在区分小肝癌（AUC=0.866）和诊断AFP阴性的HCC（准确率80.6%）方面也有着较好的性能。另一项研究以血清视黄醇和视黄醛水平为基础建立了逻辑回归模型，在区分HCC和健康对照时其AUC、灵敏度和特异度分别为0.933、85%和90%，在区分HCC和肝硬化时其AUC、灵敏度和特异度分别为0.853、80%和85%。Banales等建立了一个血清代谢物诊断模型[甘氨酸、天冬氨酸、鞘磷脂（42∶3）和鞘磷脂（43∶2）]用于区分HCC和肝内胆管细胞癌，AUC达0.890，灵敏度75%，特异度90%。由羟基嘌呤和脯氨酸组成的模式识别模型在诊断HCC时较AFP有更好的诊断性能，该模型在训练集和验证集的AUC分别为0.90和0.84，而AFP在训练集和验证集的AUC仅为0.69和0.68。除此之外，Lewinska等还基于支持向量机模型和平均重要性排序的代谢物[亚油酸、osbondacid、单不饱和脂肪酸（14∶1n-5trans）及卵磷脂（18∶2/0∶0）]，构建了一个可以有效区分非酒精性脂肪性肝病相关HCC和其他对照疾病的诊断评分。综上所述，相比传统的AFP，应用血清代谢物组合模型可以更有效地预测和诊断HCC。然而，鉴于上述代谢物组合模型目前尚未在广泛的人群中进行验证和评估，仍需要对其进一步深入广泛研究，才有机会真正应用于临床实践。二、代谢组学在HCC诊断和预测领域的应用及其局限性尽管目前尚未开发出用于HCC早诊的血清代谢物试剂盒，但来自中国科学院大连化学物理研究所的许国旺团队已开发出了可用于预测HCC患者预后的血清代谢物试剂盒，该团队还开发有包括基于血清脂质代谢物组合的用于肺癌诊断试剂盒在内的多种疾病相关试剂盒。如何将代谢物与其生物学作用联系起来，探索代谢物之间相互作用及代谢物与疾病关联的背后机制亦是当前尚待解决的问题。