生物技术与功能性油脂全解课件

第四章生物技术与功能性油脂第一节微生物油脂一、能产油脂的微生物微生物油脂称为单细胞油脂(SCO)。目前研究得较多的是酵母、藻类和霉菌,能产油脂的细菌则较少。1．富含油脂的酵母菌主要有:油脂酵母(Lipomyces)、红酵母(Rhodotorula)、假丝酵母(Candida)、油脂酵母(EndomycesVernalis)等,含油脂量30%－70%。2．富含油脂的丝状真菌有：曲霉属(Aspergillus)(A.ochraceus,Cladosporiumfulvum,C.herbarum,Choanphoracucurbitarum)等等，含油量可达菌体干重的25%－65%。第四章生物技术与功能性油脂13.富含油脂的藻类:螺旋藻（总脂肪含量约7％）、小球藻富含油脂，许多海洋微藻及巨藻类中均含有EPA或DHA。能产生DHA的自养性藻种主要集中于涡鞭毛藻纲（Dinophylceae）及prymenesiophyceae纲,其他则较少,涡鞭毛藻（Dinoflagellates）的特征为总脂肪中含有极高的DHA（12%－34%）；同时亦含有相当数量的EPA。4.细菌油脂:大多数产油细菌不产甘油三酸酯,而是积累复杂的类脂,如磷脂、糖脂等。3.富含油脂的藻类:2二、微生物油脂的组成

表微生物油脂、母乳脂肪和月见草油的脂肪酸组成比较

脂肪酸(%)微生物油脂母乳脂肪月见草油肉豆蔻酸0.6－0.84－110.1－0.2棕榈酸25－2820－255－0棕榈油酸1－2.53－50.1－0.2硬脂酸4－105－71.5－3.5油酸40－5026－306－11亚油酸10－1312－2065－80γ一亚麻酸0.2－122－33－15α-亚麻酸－1－20.1－0.2二、微生物油脂的组成3三、微生物油脂的生产（一）发酵条件对油脂生成量的影响1．温度一般情况下微生物油脂生成温度与微生物生长适宜温度一致,大多数在25－30℃,而低温培养时生成的不饱和脂肪酸含量增加。2．生长期

微生物细胞的含油量因培养时间而有显著的差异。油脂最大收获量的培养条件与细胞油脂最大含量或细胞最大收获量的培养条件一般不同。三、微生物油脂的生产44．

糖浓度和C/N一般情况下,培养基中含氮量越高则细胞中蛋白质含量越高；如果培养基中氮浓度一定，含C越高,油脂积累越多。但碳源太多渗透压高不利于菌体生长。下面列举较好的培养条件：①毛孢子菌属Trichosporon和内孢菌属Endomyces:7.5%糖，0.0233%氮。②镰刀菌属Fusarium:13%糖,0.11%蛋白胨。③红酵母Rhdotorulagracilis:100g糖,0.5g氮。

4．糖浓度和C/N55．通风量油脂是由基质的糖类还原而生成,微生物细胞的增殖也需要大量的氧,因此在深层培养中通入一定的风量是必要的。6．矿物元素矿物元素对各种菌株的影响不同一般来说,在比生长适当浓度稍高的矿物元素浓度下油脂会蓄积,但太高时就被阻止。（二）微生物油脂生产的原料碳源：有葡萄糖、果糖、蔗糖、石蜡等氮源：有胺盐、尿素、玉米浆、硝酸盐等无机盐：有氯化钾、硫酸镁以及铁、锌等离子5．通风量6

工业上一般使用亚硫酸纸浆废液、木材糖化液、废糖蜜、淀粉工业废液和石油等作为基础发酵液。菌株大规模培养使用深层培养法。（三）微生物油脂的提取1．菌体油脂提取方法：压榨和溶剂萃取法2．前处理方法：1）将干燥菌株与沙一起磨碎2）稀盐酸处理,将酵母与稀盐酸共煮,细胞分解可得中性脂肪，得率很高。3）自溶法,如将酵母在50℃下保温2－3d,自消化后回收脂肪4）以乙醇或丙酮使结合蛋白质变性,常用的溶剂有乙醚、异丙基醚等。工业上一般使用亚硫酸纸浆废液、木材糖化液、废糖蜜、淀粉7第二节γ一亚麻酸的发酵生产一、概述(一)γ-亚麻酸及其生理作用1．γ-亚麻酸(γ-Linolenicacid,简称GLA)，为全顺6,9,12一十八碳三烯酸。2．γ－亚麻酸是人体必需脂肪酸之一，是合成人体一系列前列腺素的前体物质，具有许多重要的生理功能，可用于医药、食品、化妆品等。将γ－亚麻酸（可用环糊精包埋）添加到食品中可对人体起到如下保健作用:第二节γ一亚麻酸的发酵生产8（二）γ－亚麻酸的研究进展二、利用微生物发酵法生产γ－亚麻酸（一）

生产方法发酵法生产γ－亚麻酸是利用某些真菌γ－亚麻酸含量较高的特性,采用生物工程技术选育出菌株，然后以葡萄糖为原料,经斜面、摇瓶、小罐、中罐、大罐等系列无菌培养,获得菌体细胞,再在真空低温不破坏有效成分的条件下干燥得到菌体细胞干粉。这种菌体细胞干粉富含γ－亚麻酸及亚油酸等不饱和脂肪酸,用超临界C02作萃取剂,将γ－亚麻酸萃取出来,就得到不含任何溶剂残余的γ－亚麻酸油。它不仅产量高、成本低,而且纯度也超过了从月见草油中提取的γ-亚麻酸。（二）γ－亚麻酸的研究进展9（二）γ－亚麻酸产生菌能用于生产含γ－亚麻酸油脂的微生物属于真菌中的接合菌,包括被孢霉属(Mortierlla)、根霉属(Rhizopus)、小克银汉曲霉、枝霉属(Thamidium)和螺旋藻属(Spirulina)的某些菌株。1985年日本OsamaSuzuki等人对深黄被孢霉(Mortierellaisabdllina)、拉曼被孢霉(M.ramanniana)和矮被孢霉(M.nana)进行了含葡萄糖60-400g/L的高浓度碳源发酵培养,结果菌株油脂含量35%－70%,脂肪酸中γ-亚麻酸含量为3%－11%。1987年衰岛良一等人用雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)发酵生产γ-亚麻酸,其含量可达18%左右。（二）γ－亚麻酸产生菌10

由于一般野生菌株γ-亚麻酸的含量较低,所以常需通过育种以得到γ-亚麻酸高产变异菌株。目前对菌株γ－亚麻酸的产生与调控机制还不很清楚,只能采取传统的物理或化学方法进行随机的诱变育种与随机筛选。利用螺旋藻生产γ－亚麻酸还需从以下3个方面来研究提高其产量:(1)寻找合适的培养条件;(2)设计合理的培养系统;(3)选育高产γ－亚麻酸的菌株由于一般野生菌株γ-亚麻酸的含量较低,所以常11

1992年Andrew等人发现,由油酸到亚油酸再到γ-亚麻酸、α-亚麻酸以及其他一系列脂肪酸的脱饱和作用,是由几种不同的脱饱和酶在起作用。1992年Cohen等人发现有几种吡啶族的除草剂能抑制脂肪酸脱饱和,SAN9785是ω－3脱饱和的最有效的抑制剂。如能筛选出抗SAN9785抑制ω－3脱饱和的菌株,就有可能形成γ－亚麻酸的高产菌株。用此法测出抗SAN9785菌株的γ－亚麻酸含量由21.19%提高到23.6%,脂肪酸含量由4.09%提高到6.07%。

1992年Andrew等人发现,由油酸到亚油酸12

（三）生产工艺要求1.菌种要求对用于工业化生产γ－亚麻酸油脂的菌种要求是:1）单位培养液的菌体得率高(大于20%)；2）油脂含量接近或超过一般的油料植物(25%－50%)；3）油脂中γ－亚麻酸含量高(5%－15%)；4）适应在高浓度培养基中的发酵培养以达到菌体产量大、发酵罐利用率高的要求。（三）生产工艺要求132.发酵条件菌种培养温度：28℃－30℃通风搅拌培养：通气量为2m3/(m3·min),搅拌速度400r/min发酵时间：4d发酵培养液参考配方如下:葡萄糖10%,(NH4)2S040.5%,NaAc0.3%,KH2P040.1%,MgS04·7H200.05%,酵母膏0.02%和蛋白胨0.01%。在发酵培养前期菌种主要利用氮源增大细胞体积。从第三天开始以消耗碳源为主,菌体细胞分裂程度剧烈上升,进入对数生长期,同时菌体细胞内油脂蓄积增加。2.发酵条件14（四）油脂抽提由于油滴存在于菌体细胞内,需采用球磨机或高压匀浆机将菌体细胞进行机械破碎。充分研磨后的破碎菌体干燥后可用CO2超临界萃取γ－亚麻酸或先后用乙醇和正己烷分步抽提油脂,也可用氯仿与甲醇按2:1的体积比的混合溶剂抽提油脂。（四）油脂抽提15第三节发酵法制备EPA与DHA一、概述使用微生物大量生产多不饱和脂肪酸,比从海水鱼中提取有明显的优点：1)藻油中的EPA比鱼油显示出更大的氧化稳定性,而且没有鱼腥味2)使用基因工程选育菌种有可能大大提高藻类和真菌产生EPA、DHA和其他多不饱和脂肪酸的潜力。二、产生EPA与DHA的微生物真菌：被孢霉（Mortiereuaalpina）：用于产生EPA海生真菌脆霉（Thraustochytriumaureum）：用于产生DHA。第三节发酵法制备EPA与DHA16

藻类：

角叉菜属（Chondrumcrispus）、珊瑚藻属(Corallinaofficinalis)、小球藻属(Chlorellaminutissima)：用于生产EPA如高山被孢霉(Mortierellaalpina)是进行EPA商业生产的一个潜在来源，这种真菌生长在12℃的低温条件下,可积累占总脂肪酸15%以上EPA；又如水霉目的脆霉（Thraustochytriumaureum）是一种海生真菌,其DHA的含量特别高,占总脂肪酸的34%；如日本种植的一种小球藻（Chlorellamimutissima），其油脂中含有90％EPA。藻类：17三、微生物体内EPA与DHA的合成途径多不饱和脂肪酸的合成通常是以单不饱和脂肪酸油酸为底物,合成中有2个主要的反应：碳链的增长和去饱和作用。1.碳链的增长：增加碳链长度是通过引入供体乙酰辅酶A或丙二酸辅酶A上的2个碳原子。2.EPA和DHA的合成途径：

三、微生物体内EPA与DHA的合成途径18

油酸(C18:1ω-9)

一2H↓去饱和亚油酸(18:2ω-6)

-2H↓去饱和α-亚麻酸(C18:3ω-3)

C2↓增链二十碳三烯酸(C20:3ω-3)

-2H↓去饱和二十碳四烯酸(C20:4ω-3)

－2H↓去饱和二十碳五烯酸(C20:5ω-3,EPA)

C2↓增链二十二碳五烯酸(C22:5ω-3)-2H↓去饱和二十二碳六烯酸(C22:6ω-3,DHA)

图微生物体内的EPA与DHA的生物合成途径

油酸(C18:19四、微生物合成多不饱和脂肪酸的影晌因素1.培养基的组成与pH氮量：培养基中的氮量会影响绿藻、细菌和真菌生成饱和与不饱和脂肪酸的比例。增加氮含量,EPA比例增加。C/N：对于异养微生物(如真菌),氮和碳含量都影响着脂质的产生。高C/N比将增加拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)生成物中多不饱和脂肪酸的含量。氮源：不同氮源对微生物体内多不饱和脂肪酸的积累也有影响。游离脂肪酸：游离脂肪酸的存在通常会抑制微生物体内其他脂肪酸的合成。四、微生物合成多不饱和脂肪酸的影晌因素20金属离子：部分金属离子如Cu2+、Zn2+、Mn2＋等可促进微生物菌丝体内脂肪酸的合成。

pH：培养基的初始pH保持在6.0～7.6有利于真菌和藻类产生EPA。

2.温度、时间、通气量和光照强度温度:1）嗜冷微生物在低于20℃温度下会产生更多的多不饱和脂肪酸2）嗜热微生物一般很少产生多不饱和脂肪酸3）在低温下,能增加蓝绿藻类、细菌、真核藻类、酵母和真菌菌丝体内不饱和脂肪酸的合成。真菌被孢霉仅在低温(12－15℃)下才能产生大量的EPA。金属离子：部分金属离子如Cu2+、Zn2+、Mn2＋等可促21时间：在很多微生物体内,不饱和脂肪酸是随着时间的延长而减少。一般微生物在对数生长期的末尾或稳定期的开始,多不饱和脂肪酸浓度达到最大值,在随后的稳定期与衰亡期逐渐减少。O2：

去饱和作用需要分子氧,增加培养基中的氧浓度有助于提高不饱和脂肪酸含量。光照强度：对于许多光合成藻类,光照不足将增加ω-6脂肪酸的合成而抑制ω-3脂肪酸的合成。五、微生物油中EPA和DHA的浓缩分离方法时间：在很多微生物体内,不饱和脂肪酸是随着时间的延长而减少。221.低温结晶法饱和脂肪酸的凝固点高于不饱和脂肪酸,可利用此特性将混合脂肪酸中的不饱和脂肪酸分离开。另外,利用脂肪酸在不同溶剂中的溶解度不同,再结合低温处理,往往会得到更好的分离效果。但这些方法只能作为EPA和DHA的预浓缩处理。产物中的EPA浓度可达总脂肪酸的25%－35%。2.脂肪酸盐结晶法利用脂肪酸的不同盐(或酯)在不同溶剂中的溶解度不同来进行分离,如铅盐乙醇法、锂(或钠)盐丙酮法和钡盐苯法。1.低温结晶法233．酸银柱法AgNO3与多不饱和脂肪酸能形成可逆的强极性复合物,因此可用AgNO3柱等来富集DHA和EPA。4.选择性酶水解和酯交换利用各种脂肪水解酶的专一性,选择性水解甘油三酯中非多不饱和脂肪酸部分,或利用酯交换特性在甘油三酯分子上接上2－3个多不饱和脂肪酸分子而起到富集、纯化作用。5.尿素复合法尿素会与长链有机化合物相结合并结晶析出,这种结合能力与有机化合物分子大小与形状有关

3．酸银柱法246.减压蒸馏和分子蒸馏法由于脂肪酸的沸点较高,常压下蒸馏时可能出现分解现象,因此需在减压条件下进行蒸馏。通常是将脂肪酸酯化(例如甲酯化或乙酯化)后再行蒸馏,因为脂肪酸酯的沸点较相应的游离脂肪酸沸点低,而且脂肪酸酯的沸点间隔可以拉开。利用高真空分子蒸馏法(如0.013Pa)分离脂肪酸可起到浓缩、分离和精制等多方面效果,已成功地应用在EPA和DHA的分离、精制上。

6.减压蒸馏和分子蒸馏法257.超临界萃取法用超临界CO2萃取提纯DHA和EPA,一般需先将多不饱和脂肪酸的甘油三酯形式转变为游离脂肪酸或脂肪酸甲酯(乙酯),以增加其在超临界CO2中的溶解度。脂肪酸链长和饱和度不同,其在超临界CO2和油相中的分配系数不同,从而得到分离。8.工业制备色谱法9.综合方法7.超临界萃取法26六、EPA与DHA的抗氧化保护1.EPA与DHA及其制品的抗氧化保护方法：可采用避光、避热、低真空、充氮、加抗氧剂和除氧等方法来实施,还可制成胶囊和微胶囊来保存。2.要防止EPA和DHA的氧化,需要综合使用排除氧气、降低保藏温度、添加抗氧化剂和避免混入Cu2＋、Fe2+等措施。3.将EPA与DHA油进行微胶囊包埋,可防止由于氧、光照等造成的氧化变质,掩盖不良风味和色泽。六、EPA与DHA的抗氧化保护27七、酶催化合成富含EPA的植物油在微生物系统中,已证实α-亚麻酸通过ω-3途径可以被转化为EPA。Shimizu等人发现被孢霉属真菌可以把油脂中的α-亚麻酸转化为EPA,培养基中以葡萄糖为主要碳源。亚麻籽油由于含有大约占总脂肪酸60%的α-亚麻酸,所以最适合用来作为原料油。在优化的培养条件下,亚麻籽油中有5.1%的α-亚麻酸可被转化为EPA。七、酶催化合成富含EPA的植物油28第四章生物技术与功能性油脂第一节微生物油脂一、能产油脂的微生物微生物油脂称为单细胞油脂(SCO)。目前研究得较多的是酵母、藻类和霉菌,能产油脂的细菌则较少。1．富含油脂的酵母菌主要有:油脂酵母(Lipomyces)、红酵母(Rhodotorula)、假丝酵母(Candida)、油脂酵母(EndomycesVernalis)等,含油脂量30%－70%。2．富含油脂的丝状真菌有：曲霉属(Aspergillus)(A.ochraceus,Cladosporiumfulvum,C.herbarum,Choanphoracucurbitarum)等等，含油量可达菌体干重的25%－65%。第四章生物技术与功能性油脂293.富含油脂的藻类:螺旋藻（总脂肪含量约7％）、小球藻富含油脂，许多海洋微藻及巨藻类中均含有EPA或DHA。能产生DHA的自养性藻种主要集中于涡鞭毛藻纲（Dinophylceae）及prymenesiophyceae纲,其他则较少,涡鞭毛藻（Dinoflagellates）的特征为总脂肪中含有极高的DHA（12%－34%）；同时亦含有相当数量的EPA。4.细菌油脂:大多数产油细菌不产甘油三酸酯,而是积累复杂的类脂,如磷脂、糖脂等。3.富含油脂的藻类:30二、微生物油脂的组成

表微生物油脂、母乳脂肪和月见草油的脂肪酸组成比较

脂肪酸(%)微生物油脂母乳脂肪月见草油肉豆蔻酸0.6－0.84－110.1－0.2棕榈酸25－2820－255－0棕榈油酸1－2.53－50.1－0.2硬脂酸4－105－71.5－3.5油酸40－5026－306－11亚油酸10－1312－2065－80γ一亚麻酸0.2－122－33－15α-亚麻酸－1－20.1－0.2二、微生物油脂的组成31三、微生物油脂的生产（一）发酵条件对油脂生成量的影响1．温度一般情况下微生物油脂生成温度与微生物生长适宜温度一致,大多数在25－30℃,而低温培养时生成的不饱和脂肪酸含量增加。2．生长期

微生物细胞的含油量因培养时间而有显著的差异。油脂最大收获量的培养条件与细胞油脂最大含量或细胞最大收获量的培养条件一般不同。三、微生物油脂的生产324．

糖浓度和C/N一般情况下,培养基中含氮量越高则细胞中蛋白质含量越高；如果培养基中氮浓度一定，含C越高,油脂积累越多。但碳源太多渗透压高不利于菌体生长。下面列举较好的培养条件：①毛孢子菌属Trichosporon和内孢菌属Endomyces:7.5%糖，0.0233%氮。②镰刀菌属Fusarium:13%糖,0.11%蛋白胨。③红酵母Rhdotorulagracilis:100g糖,0.5g氮。

4．糖浓度和C/N335．通风量油脂是由基质的糖类还原而生成,微生物细胞的增殖也需要大量的氧,因此在深层培养中通入一定的风量是必要的。6．矿物元素矿物元素对各种菌株的影响不同一般来说,在比生长适当浓度稍高的矿物元素浓度下油脂会蓄积,但太高时就被阻止。（二）微生物油脂生产的原料碳源：有葡萄糖、果糖、蔗糖、石蜡等氮源：有胺盐、尿素、玉米浆、硝酸盐等无机盐：有氯化钾、硫酸镁以及铁、锌等离子5．通风量34

工业上一般使用亚硫酸纸浆废液、木材糖化液、废糖蜜、淀粉工业废液和石油等作为基础发酵液。菌株大规模培养使用深层培养法。（三）微生物油脂的提取1．菌体油脂提取方法：压榨和溶剂萃取法2．前处理方法：1）将干燥菌株与沙一起磨碎2）稀盐酸处理,将酵母与稀盐酸共煮,细胞分解可得中性脂肪，得率很高。3）自溶法,如将酵母在50℃下保温2－3d,自消化后回收脂肪4）以乙醇或丙酮使结合蛋白质变性,常用的溶剂有乙醚、异丙基醚等。工业上一般使用亚硫酸纸浆废液、木材糖化液、废糖蜜、淀粉35第二节γ一亚麻酸的发酵生产一、概述(一)γ-亚麻酸及其生理作用1．γ-亚麻酸(γ-Linolenicacid,简称GLA)，为全顺6,9,12一十八碳三烯酸。2．γ－亚麻酸是人体必需脂肪酸之一，是合成人体一系列前列腺素的前体物质，具有许多重要的生理功能，可用于医药、食品、化妆品等。将γ－亚麻酸（可用环糊精包埋）添加到食品中可对人体起到如下保健作用:第二节γ一亚麻酸的发酵生产36（二）γ－亚麻酸的研究进展二、利用微生物发酵法生产γ－亚麻酸（一）

生产方法发酵法生产γ－亚麻酸是利用某些真菌γ－亚麻酸含量较高的特性,采用生物工程技术选育出菌株，然后以葡萄糖为原料,经斜面、摇瓶、小罐、中罐、大罐等系列无菌培养,获得菌体细胞,再在真空低温不破坏有效成分的条件下干燥得到菌体细胞干粉。这种菌体细胞干粉富含γ－亚麻酸及亚油酸等不饱和脂肪酸,用超临界C02作萃取剂,将γ－亚麻酸萃取出来,就得到不含任何溶剂残余的γ－亚麻酸油。它不仅产量高、成本低,而且纯度也超过了从月见草油中提取的γ-亚麻酸。（二）γ－亚麻酸的研究进展37（二）γ－亚麻酸产生菌能用于生产含γ－亚麻酸油脂的微生物属于真菌中的接合菌,包括被孢霉属(Mortierlla)、根霉属(Rhizopus)、小克银汉曲霉、枝霉属(Thamidium)和螺旋藻属(Spirulina)的某些菌株。1985年日本OsamaSuzuki等人对深黄被孢霉(Mortierellaisabdllina)、拉曼被孢霉(M.ramanniana)和矮被孢霉(M.nana)进行了含葡萄糖60-400g/L的高浓度碳源发酵培养,结果菌株油脂含量35%－70%,脂肪酸中γ-亚麻酸含量为3%－11%。1987年衰岛良一等人用雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)发酵生产γ-亚麻酸,其含量可达18%左右。（二）γ－亚麻酸产生菌38

由于一般野生菌株γ-亚麻酸的含量较低,所以常需通过育种以得到γ-亚麻酸高产变异菌株。目前对菌株γ－亚麻酸的产生与调控机制还不很清楚,只能采取传统的物理或化学方法进行随机的诱变育种与随机筛选。利用螺旋藻生产γ－亚麻酸还需从以下3个方面来研究提高其产量:(1)寻找合适的培养条件;(2)设计合理的培养系统;(3)选育高产γ－亚麻酸的菌株由于一般野生菌株γ-亚麻酸的含量较低,所以常39

1992年Andrew等人发现,由油酸到亚油酸再到γ-亚麻酸、α-亚麻酸以及其他一系列脂肪酸的脱饱和作用,是由几种不同的脱饱和酶在起作用。1992年Cohen等人发现有几种吡啶族的除草剂能抑制脂肪酸脱饱和,SAN9785是ω－3脱饱和的最有效的抑制剂。如能筛选出抗SAN9785抑制ω－3脱饱和的菌株,就有可能形成γ－亚麻酸的高产菌株。用此法测出抗SAN9785菌株的γ－亚麻酸含量由21.19%提高到23.6%,脂肪酸含量由4.09%提高到6.07%。

1992年Andrew等人发现,由油酸到亚油酸40

（三）生产工艺要求1.菌种要求对用于工业化生产γ－亚麻酸油脂的菌种要求是:1）单位培养液的菌体得率高(大于20%)；2）油脂含量接近或超过一般的油料植物(25%－50%)；3）油脂中γ－亚麻酸含量高(5%－15%)；4）适应在高浓度培养基中的发酵培养以达到菌体产量大、发酵罐利用率高的要求。（三）生产工艺要求412.发酵条件菌种培养温度：28℃－30℃通风搅拌培养：通气量为2m3/(m3·min),搅拌速度400r/min发酵时间：4d发酵培养液参考配方如下:葡萄糖10%,(NH4)2S040.5%,NaAc0.3%,KH2P040.1%,MgS04·7H200.05%,酵母膏0.02%和蛋白胨0.01%。在发酵培养前期菌种主要利用氮源增大细胞体积。从第三天开始以消耗碳源为主,菌体细胞分裂程度剧烈上升,进入对数生长期,同时菌体细胞内油脂蓄积增加。2.发酵条件42（四）油脂抽提由于油滴存在于菌体细胞内,需采用球磨机或高压匀浆机将菌体细胞进行机械破碎。充分研磨后的破碎菌体干燥后可用CO2超临界萃取γ－亚麻酸或先后用乙醇和正己烷分步抽提油脂,也可用氯仿与甲醇按2:1的体积比的混合溶剂抽提油脂。（四）油脂抽提43第三节发酵法制备EPA与DHA一、概述使用微生物大量生产多不饱和脂肪酸,比从海水鱼中提取有明显的优点：1)藻油中的EPA比鱼油显示出更大的氧化稳定性,而且没有鱼腥味2)使用基因工程选育菌种有可能大大提高藻类和真菌产生EPA、DHA和其他多不饱和脂肪酸的潜力。二、产生EPA与DHA的微生物真菌：被孢霉（Mortiereuaalpina）：用于产生EPA海生真菌脆霉（Thraustochytriumaureum）：用于产生DHA。第三节发酵法制备EPA与DHA44

藻类：

角叉菜属（Chondrumcrispus）、珊瑚藻属(Corallinaofficinalis)、小球藻属(Chlorellaminutissima)：用于生产EPA如高山被孢霉(Mortierellaalpina)是进行EPA商业生产的一个潜在来源，这种真菌生长在12℃的低温条件下,可积累占总脂肪酸15%以上EPA；又如水霉目的脆霉（Thraustochytriumaureum）是一种海生真菌,其DHA的含量特别高,占总脂肪酸的34%；如日本种植的一种小球藻（Chlorellamimutissima），其油脂中含有90％EPA。藻类：45三、微生物体内EPA与DHA的合成途径多不饱和脂肪酸的合成通常是以单不饱和脂肪酸油酸为底物,合成中有2个主要的反应：碳链的增长和去饱和作用。1.碳链的增长：增加碳链长度是通过引入供体乙酰辅酶A或丙二酸辅酶A上的2个碳原子。2.EPA和DHA的合成途径：

三、微生物体内EPA与DHA的合成途径46

油酸(C18:1ω-9)

一2H↓去饱和亚油酸(18:2ω-6)

-2H↓去饱和α-亚麻酸(C18:3ω-3)

C2↓增链二十碳三烯酸(C20:3ω-3)

-2H↓去饱和二十碳四烯酸(C20:4ω-3)

－2H↓去饱和二十碳五烯酸(C20:5ω-3,EPA)

C2↓增链二十二碳五烯酸(C22:5ω-3)-2H↓去饱和二十二碳六烯酸(C22:6ω-3,DHA)

图微生物体内的EPA与DHA的生物合成途径

油酸(C18:47四、微生物合成多不饱和脂肪酸的影晌因素1.培养基的组成与pH氮量：培养基中的氮量会影响绿藻、细菌和真菌生成饱和与不饱和脂肪酸的比例。增加氮含量,EPA比例增加。C/N：对于异养微生物(如真菌),氮和碳含量都影响着脂质的产生。高C/N比将增加拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)生成物中多不饱和脂肪酸的含量。氮源：不同氮源对微生物体内多不饱和脂肪酸的积累也有影响。游离脂肪酸：游离脂肪酸的存在通常会抑制微生物体内其他脂肪酸的合成。四、微生物合成多不饱和脂肪酸的影晌因素48金属离子：部分金属离子如Cu2+、Zn2+、Mn2＋等可促进微生物菌丝体内脂肪酸的合成。

pH：培养基的初始pH保持在6.0～7.6有利于真菌和藻类产生EPA。

2.温度、时间、通气量和光照强度温度:1）嗜冷微生物在低于20℃温度下会产生更多的多不饱和脂肪酸2）嗜热微生物一般很少产生多不饱和脂肪酸3）在低温下,能增加蓝绿藻类、细菌、真核藻类、酵母和真菌菌丝体内不饱和脂肪酸的合成。真菌被孢霉仅在低温(12－15℃)下才能产生大量的EPA。金属离子：部分金属离子如Cu2+、Zn2