实验一氨基酸及蛋白质性质

第一部份基础生化实验

实验一氨基酸及蛋白质的性质【实验目的】加深明白得所学有关的蛋白质性质的理论知识把握氨基酸和蛋白质经常使用的定性、定量分析的方式及原理一、蛋白质呈色反映蛋白质的呈色反映是指蛋白质所含的某些氨基酸及其特殊结构，在必然条件下可与某些试剂发生了生成有色的物质的反映。不同蛋白质分子所含的氨基酸残基也是不完全相同，因此所发生的成色反映也不完全一样。另外呈色反映并非是蛋白质的专一反映，某些非蛋白质类物质（含有-CS-NH、-史-叫、-CRH-N%-如眼史叫等基团的物质）也能发生类似的颜色反映。因此，不能仅仅依照呈色反映的结果为阳性就来判定被测物质必然是蛋白质。注意：本次实验为定性实验，试剂的量取用滴管完成。（一）双缩脲反映【实验原理】当尿素经加热至180°C左右时，两分子尿素脱去一分子氨，进而缩合成一分子双缩月尿。其在碱性条件下双缩月尿与铜离子结合成红紫色络合物，此反映称为双缩腿反映。其反映进程如下：七=0+气=。h七=0+气=。h2nh2n0O△flI1800「Ah2ncnhcnh2+NH3HHIR-C一HHIR-C一NR-CH0=C——多肽及蛋白质分子结构中均含有许多肽键，其结构与双缩尿分子中的亚酰胺键相同。因此，在碱性条件下与铜离子也能呈现出类似于双缩尿的呈色反映。其反映进程如下：NHsIR-CHI血IR-CHIo=cR-CH-CII【试剂】蛋白质溶液（鸡蛋清用蒸馏水稀释10倍，通过2-3层沙布滤去不容物）%甘氨酸溶液

%精氨酸溶液10%NaOH溶液1%CuSO4溶液尿素结晶【实验操作】双缩脲的制备取少量尿素结晶（约火柴头大小）放入干燥的试管中，微火加热至尿素熔解至硬化，刚硬化时当即停止加热，现在双缩腿即已形成。冷却后加10%氢氧化钠溶液约1ml、并震荡，再加入1%硫酸铜溶液2滴，再震荡，观看颜色的转变。注意：a.在操作进程中试管不能冲向其他人以避免烫伤；操纵加热的时刻既不能太长也不能太短；加热时火不能太大，避免碳化。观看现象另外取试管4支，依照下表加入各类试剂，观看并说明现象。表1.试剂12管号3—蛋白质样液（ml）%精氨酸（ml）%甘氨酸（ml）10%NaOH（ml）蒸馏水（ml）现象（二）茚三酮反映【实验原理】在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此反映为一切蛋白质和a一氨基酸所共有（亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物）。含有氨基的其他化合物亦可发生此反映。O/OHO/OH■^^C/C'oHOHOOR_f—COOHOO+RCHO++RCHO+NH3+CO2\OH第二步:

C建=0+2叫O+2H2C建=0+2叫O+2H2O1.2.%茚三酮溶液【实验方式】取试管2支，别离加入蛋白质样液及0.1%甘氨酸溶液1ml,然后各加入茚三酮溶液，混匀后于滚水浴中加热数分钟，观看现象，记录结果并说明缘故。（三）蛋白黄反映【实验原理】在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等）残基上的苯环经硝酸作用可生成黄色的硝基化合物，在碱性条件下生成物可转变成桔黄色的硝醍衍生物，反映为：OH+HNO3HONO2+hOH+HNO3HONO2+h2oNaOH多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，因此都会发生黄色反映。苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸后才能够发生黄色反映。【试剂】蛋白质溶液（与双缩脲反映相同）浓硝酸20%Na0H溶液%石炭酸溶液【实验操作】取1%石炭酸溶液约1ml放在试管内，加浓硝酸5滴，用微火警惕加热，观看结果。取干燥干净试管1支，加蛋白质样液1ml和浓硝酸5滴，显现沉淀，加热，没必要至沸腾，那么沉淀变成黄色，待试管冷却后，向两管各加20%Na0H溶液使成碱性，观看颜色转变，记录结

果并说明现象。（四）坂口反映【实验原理】果并说明现象。（四）坂口反映蛋白质在碱性溶液中与次氯酸盐（或次漠酸盐）和a-萘酚作用产生红色的产物。这是由于蛋白质分子中精氨酸胍基的特点反映。许多胍的衍生物如胍乙酸、胍基丁胺等也发生此反映。精氨酸是唯一呈正反映的氨基酸，反映灵敏度达1：250000。反映方程式为-NH2NHNHCH2CH2fH-NH2NHNHCH2CH2fH—NH2COOHHONHOCLCLCLfH一NH2COOH+NH3生成的氨可被次漠酸钠氧化生成氮。在次漠酸钠缓慢作用下，有色物质继续氧化，引发颜色消失，因此过量的次漠酸钠对反映不利。加入浓尿素，破坏过量的次漠酸钠，能增加颜色的稳固性。此反映能够用来定性鉴定含有精氨酸的蛋白质和定量测定精氨酸的含量。【试剂】蛋白质溶液：与双缩尿反映相同次漠酸钠溶液10%NaOH溶液%a-萘酚溶液%精氨酸溶液【实验操作】于试管中加入蛋白质溶液1ml，再加10%NaOH溶液，％a-萘酚2滴，混合后再加次漠酸钠溶液2滴，观看现象取％精氨酸溶液1ml，按上述操作观看现象蛋白质沉淀反映蛋白质是亲水胶体，当其稳固因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出，此现象叫蛋白质的沉淀反映。（一）蛋白质的盐析作用【实验原理】盐析现象是指一般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至必然浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关：①蛋白质分子被浓盐脱水；②分子所带电荷被中和。蛋白质的盐析作用是可逆进程，用盐析方式沉淀蛋白质时，较少引发蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如清蛋白）易于析出。球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。【试剂】鸡蛋清的氯化钠溶液（一份鸡蛋清加10份的%氯化钠溶液）固体硫酸铵10%氢氧化钠溶液1%硫酸铜溶液【实验操作】取鸡蛋清氯化钠溶液约2ml于试管中，加入硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和再也不溶解为止，现在溶液颜色为乳白色，用滤纸过滤。取滤液做双缩脲反映，检查滤液中有无蛋白质存在。蛋白质沉淀用1ml蒸馏水溶解后作双缩脲反映，证明盐析的蛋白质从头溶解于水而未引发变性。（二）重金属盐类沉淀蛋白质【实验原理】溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类（如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等）易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故经常使用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在利用某些重金属盐（如硫酸铜或醋酸铅）沉淀蛋白质时，不可过量，不然将引发沉淀再溶解。【试剂】蛋白质溶液（与双缩脲反映相同）5%CuS04溶液3%AgNO3溶液【实验操作】取试管2支各加蛋白质溶液1ml向各管别离滴加2-3滴加5%CuS04溶液、3%AgNO3溶液，观看各管所生成的沉淀。在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部份沉淀，留少量沉淀，继续加入5%CuS04溶液，观看沉淀的溶解。（三）有机酸沉淀蛋白质【实验原理】生物碱是植物中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反映的物质，称为生物碱试剂。如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。当蛋白质溶液pH值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成性盐而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此普遍的被用于沉淀蛋白质。【试剂】蛋白质溶液（与双缩脲反映相同）10%三氯醋酸溶液20%水杨磺酸溶液【实验操作】取蛋白质溶液1ml于试管中，加数滴三氯醋酸溶液，观看现象；取蛋白质溶液1ml于试管中，加数滴水杨磺酸溶液，观看现象。（四）加热沉淀蛋白质【实验原理】大多数蛋白质在加热时，由于空间结构被破坏而丧失其稳固性，因此变性凝固。蛋白质的热变性作用与加热时刻平行，并随温度的升高而加速。短时刻加热可引发凝固。加热时，盐类的存在及溶液酸碱度对蛋白质的凝固有专门大阻碍。处于等电点状态的蛋白质加热时凝固最完全、最迅速。在强酸强碱溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负虽加热也不凝固。但溶液中假设有中性盐存在，那么蛋白质可因加热而凝固。【试剂】蛋白质溶液（与双缩脲反映相同）1%醋酸溶液10%醋酸溶液10%氢氧化钠溶液饱和氯化钠溶液【实验操作】取试管4支依下表所示添加试剂。表2.试剂管号1234蛋白质样液（ml）1%醋酸，滴1———10%醋酸，滴—10——10%NaOH，滴——10—蒸馏水，滴101111现象加毕混匀，观看各管的情形。然后放入滚水浴中加热10分，注意观看比较各管的沉淀情形。其中2号管溶液接近于蛋白质等电点，最不稳固，最先沉淀；第二是第一管；3号和4号管因在较强的酸或碱下，蛋白质带有大量的电荷，尽管加热也不沉淀。向第三管中加入少量饱和氯化钠溶液，当即显现白色沉淀。Experiment1ThePropertiesofProteinandAminoAcid(Purposes]Validatetheprincipleaboutpropertiesofproteinandaminoacidwhichwehavelearned.Masterthemethodsandprinciplesofquantitatinganddeterminingthenaturesofproteinandaminoacid.

ColorReactionsofProteinColorreactionsofproteinmeanthatsomechemicalbondsofproteinorchemicalgroupsofaminoacidresiduescanreactwithspecificreagentstoformspecificcoloredsubstances.Theaminoacidresiduesofdifferentproteinsarenotquitethesame.Therefore,colorsoftheproductsarenotexactlythesame.Colorreactionsarenotthespecificreactionsofproteinandsomenonproteinsubstances、-CH2-NH2、-CRH-NH2、-CHOH-CH2NH2)canalsohavesimilarcolorreactions.Consequentlywecannotjudgeproteinfromtheresultsofthecolorreactions.1.BiuretReactionLPrinciple]Twomoleculesofcarbamideareheatedtogiveamoleculeofbiuretwhenthetemperatureis180°Candreleaseamoleculeofammonia.Biuretreactswithanalkalinesolutionofcoppercationtogiveapurplecoloredcomplex.Thereactioniscalledbiuretreaction.Theprocessofbiuretreactionisasfollows:+./，C^OH2N\/=Oh+./，C^OH2N\/=Oh2nOH-△1800CENCNHCNH2+NH3Therearemanypeptidebondsinpolypeptidesandalloftheproteins.Thepeptidebondisthesameastheimidobondofbiuret.Thereforeproteinorpolycanreactwithanalkalinesolutionofcoppercationinasimilarwaytobiuret.Theprocessofreactionisasfollows:NH2IR-CHI。近HH—CICIN■--RoR-CH-CiiHINHHIR-CNH2IR-CHI。近HH—CICIN■--RoR-CH-CiiHINHHIR-C——N.O=C——R-CHProteinsolution(Eggwhiteisdilutedwithdistilledwatertotenvolumesandfiltratedby2--3layersofgauze)%Glycinicacidsolution%Argininicacidsolution4.10%NaOHsolution1%CuSO4solutionCrystalcarbamideLProcedures]1.Preparationofbiuret:Addalittlecrystalcarbamideintoadrytesttube,heatbyslowfiretoliquate,stopheatingwhenitbeginstovulcanize,coolandadd1ml10%NaOHsolutionandvulcanize,thenadd2dropof1%CuSO4solution,vulcanizeagain,observethechangeofthecolor.2．Observingthephenomenonoftheotherfourtesttubes,inwhichthereagentsasthefollowingtableareaddedandmixed,thenmakeanexplanation.Table1.Reagents1ProteinsolutionTesttubeLPrinciple]%Arginine(ml)%Glycin(ml)10%Na0H(ml)HQ(ml)2Phenomena2.NinhydrinReactionHeatingproteinoraminoacidwithninhydrininsubacidconditioncangetroyalpurplecondensate.Thisreactionisthemutualpropertyofallproteinsanda-aminoacids(aminoacidsuchasprolineorhydroxyprolinecangiveyellowcondensate).Othercompoundscontainingaminogroupsalsohavetheninhydrinreaction.O<^=^^^\^C\/OHLA/'oh+COO/H■^Z^C/'ohCOHR_C—COOH+RCHO+NH3+CO2OOOOO+2NH3+2H2O【Reagents】Proteinsolution(thesameasbiuretreaction)%Glycinicacidsolution%Ninhydrinsolution(Procedures]Taketwotesttubes,addfourdropsofproteinsolutioninonetubeandfourdropsof%Glycinicacidsolutionintheother,andthenaddtwodropsofninhydrinsolutionineachofthetubes.Mixupandheatthemintheboilingwaterbathforseveralminutes,observethephenomenaandmakeanexplanation.Yellowreaction(Principle]Benzeneringinresidueofaminoacidwitharomaticringinproteinmolecule(suchastyrosineandtryptophan)canreactwithnitricacidtogiveyellownitrocompound,whichcanchangeintosaffronnitrylchinonederivativeinbasiccondition.Thereactionisasfollows:OH+HNO3HO2+H2OHOno2OH+HNO3HO2+H2OHOno2+NaOHMostproteinshaveaminoacidswitharomaticring,sotheyhaveyellowreaction.Phenylalanineisnoteasytonitrify,soitisnecessarytoaddinalittlevitrioloil.(Reagents]Proteinsolution(thesameasbiuretreaction)Aquafortis.20%NaOHsolution1%carbolicacidsolution

LProcedures]Takeacleananddrytesttube,add1ml1%carbolicacidsolutionand5dropsofaquafortis,thenheatcarefullywithslowfireandobservetheresult.Takeacleananddrytesttube,add1mlproteinsamplesolutionandfivedropsofaquafortisinit,andheatintheboilingwaterbathforfiveminutes.Thenadd20%NaOHsolutionineachofthetubes,mixup.Observecolorvarieties,notedowntheresultsandexplainthem.4.SaKaguohiReaction[Principle]/NH2NHNHJHOCH2CH一NHI2COOHNH3Proteinreactwithsodiumbromatesolutionanda-naphtholsolutioninalkaliconditiontoproduceredcomponent.Thisisaspecialreactionofarginine’scarbamidine,whichisusefulinquantitatinganddeterminingthenaturesofproteinandthe/NH2NHNHJHOCH2CH一NHI2COOHNH3AACH一NHY2COOH[Reagent]Proteinsolution(thesameasbiuretreaction)Sodiumbromatesolution10%NaOHsolution%a-naphtholsolution%argininesolution[Procedures]1mlofproteinsolutionisaddedintoatesttube,thenmlof10%NaOHsolutionandtwodropsof%a-naphtholareadded.Aftermixing,2dropsofsodiumbromatesolutionareadded,andthenobservethephenomenon.Add1mlof%argininesolutionaccordingtothesameprocedureabove,thenobservethephenomenon.PrecipitationReactionsofProteinProteinishydrophiliccolloid.Proteincanbeseparatedoutfromsolutionwhenthestablefactorsaredamagedorwhenitcombineswithsomeagentstobecomeinfusibilitysalts,whichiscalledPrecipitationReactionofProtein.1.SaltingOutofProtein[Principle]Thesolubilityofmostproteinslowersatahighsaltconcentration.Asneutralsaltisaddedtotheproteinsolutionlittlebylittle,asthesaltconcentrationisincreasing,apointwillbereachedwhentheproteincomesoutofthesolutionandprecipitates.Thisiscalledsaltingout.Twofactorsrelatetosaltingout.ProteinmoleculesaredehydratedbystrongsaltsolutionThechargesofproteinmoleculesareneutralized.Precipitatingproteinbysaltingoutattributesmerelytodenaturationofprotein.Dialysisordilutedbywatercandissolvetheprecipitation.Sosaltingoutisareversibleprocess.TheneutralsaltconcentrationofprecipitatingproteinbysaltingoutrelatestothekindofproteinandpHvalue.Largemolecule(suchasglobulin)iseasiertobeseparatedoutthansmallmolecule(suchasalbumin).Halfsaturatedammoniumsulfatesolutioncanprecipitateoutglobulin,whereassaturatedammoniumsulfatesolutionisrequiredtoprecipitatealbumin.[Reagents]Eggwhite(eggwhitewith10timesof%NaClsolution)Solidammoniumsulfate10%NaOHsolution1%CuSO4solution[Procedures]About2mlofeggwhiteisplacedinatesttube.Addthesamevolumesaturatedammoniumsulfatesolution,mixroundtobeuniformity,proteinisprecipitatedoutatonce.Bestandingforseveralminutesandfiltratebyfilterpaper,theprecipitationiseggglobulin.Ifthefiltrateisnotpellucid,filtraterepeatedlyuntilpellucid.Washforementionedeggglobulinprecipitationonceby2mlofhalfsaturatedammoniumsulfatesolution,andtakelittleprecipitation(aboutmatch-headsize)inlmlofdistilledwater,observewhetheritisdissolved,identifybybiuretreaction.Placethefiltrateinatesttube,addsolidammoniumsulfatetobesaturated.Observewhethertheprecipitationisseparatedout.Ifthereisprecipitation,filtrateit.Heatthefiltrateandobservewhetherprecipitationisseparatedout,notedowntheresultandexplainthephenomena.Theprecipitationiseggalbumin.Wecantakelittleprecipitation(aboutmatchheadsize)in1mlofdistilledwater,observewhetheritisdissolved,identifybybiuretreaction.2.HeavyMetalSaltsPrecipitatingProtein[Principle]Heavymetalsalts(suchasPb2+,Cu2+,Hg2+andAg2+etc.)areeasytocombinewithproteintogiveinsolublesaltsandprecipitatewhenthepHofsolutionisabovetheisoelectricpointoftheprotein.Heavymetalsaltsprecipitatingproteinisalwayscomplete.Soheavymetalsaltsareoftenusedtoremoveproteininsolution.Butwemustpayattentionnottobeexcessivewhileusingsomeheavymetalsalts(suchasCuSO4orPbAc)toprecipitateprotein,orelseitwillcausetheprecipitationtodissolve.[Reagents]Proteinsolution(thesameasbiuretreaction)5%CuSO4solution3%AgNO3solutionLProcedures]Taketwotesttubes,andaddproteinsolution1ml.2-3dropsof5%CuS04and3%AgNO3areaddedtotwotesttubesrespectively,thenobservethephenomenon.Reserveabitofprecipitationinthetesttubewithprecipitationofprotein,thenadd5%CuSO4solutiontothetubeandobserveiftheprecipitationisdissolved,notedowntheresults.OrganicAcidPrecipitatingProteinLPrinciple]Alkaloidisakindofnitrogenbasiccompoundswithnotablephysiologicalactioninplants.Allsubstancesthatcanprecipitatealkaloidorreactwithalkaloidtogivecolorproductsarecalledalkaloidreagents,suchastannin,picrinite,phosphowol-framicacidetc.AlkaloidreagentscancombinewithwhichproteinsarecationstogiveinsolublesaltandprecipitatewhenthepHofsolutionisundertheisoelectricpointoftheprotein.Theproteincanalsobeprecipitatedbyorganicacid.Trichloroaceticacidisthemostsensitiveandspecificintheseacidandisusedwidely.LReagents]Proteinsolution(thesameasbiuretreaction);20%tanninsolution;10%trichloroaceticacidsolu