细胞凋亡及其调控分子机制

关于细胞凋亡及其调控分子机制第1页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第2页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五凋亡的概念，与坏死的区别凋亡信号通路细胞凋亡相关蛋白、细胞凋亡与疾病细胞凋亡检测第3页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五细胞凋亡名称的由来英国Aberdeen大学病理系

Kerr教授1972年我和Wyllie在研究中观察到一种不同于坏死的细胞死亡方式，联想到秋日落叶，我们就把它称作Apoptosis第4页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第5页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

SydneyBrenner1/3oftheprizeUnitedKingdomTheMolecularSciencesInstitute

Berkeley,CA,USAb.1927

(inUnionofSouthAfrica)H.RobertHorvit1/3oftheprizeUSAMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)

Cambridge,MA,USAb.1947JohnE.SulstonUnitedKingdomTheWellcomeTrustSangerInstitute

Cambridge,UnitedKingdomb.1942

THE2002NOBELPRIZEWINNER第6页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五王晓东：

从事的是细胞凋亡规律的研究。2000年，他和助手们进行了一项实验，研究一种神秘的线粒体蛋白质Smac，这种蛋白质可以打破肿瘤的“坚硬堡垒”，诱使肿瘤细胞“自杀”，对研究治疗癌症方法有重要帮助。从1996年他建立起自己的研究室后，他的论文成果在8年间被其他科学家引用超过了15000次。第7页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第一节细胞凋亡的特征及意义一、细胞凋亡的基本特征第8页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

程序性细胞死亡programmedcelldeath,PCD在发育过程中定时出现的生理性刺激诱导的细胞死亡。用于选择性地清除多细胞动物体内一些无用的或危险的细胞。依据形态学不同，程序性细胞死亡可划分为凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）、肿胀性死亡3种形式。细胞凋亡：apoptosis在生理和病理条件下，由基因控制的自主有序的死亡过程。生理条件下，凋亡用以清除单个细胞，继而由巨噬细胞内吞，最后再由溶酶体执行降解功能。自噬autophagy:是一种在进化上保守的真核细胞内转运泡的运输机制，它可将细胞本身的亚细胞成分如蛋白、胞质或细胞器，通过溶酶体中的水解酶进行消化降解和循环。凋亡和自噬都是细胞内重要的生理过程。

坏死Necrosis：各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。第9页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五诱发因素

特定的生理病理因素，药物

缺氧、药物、毒素组织分布

单个细胞分布

成片细胞组织反应

形成凋亡小体，被周围组织

细胞内容物溶解细胞吞噬，无炎症反应释放，有炎症反应

坏死凋亡第10页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五形态学：

细胞体积

皱缩变圆，细胞浆失水浓缩

肿胀，外形不规则化细胞膜

保持完整，形成泡状，凋亡破裂后期内陷包裹核物质和细胞器形成凋亡小体细胞核

核膜完整，核皱缩，染色质固缩

核肿胀破裂，

聚集在核膜下，最后核裂成碎片染色质不规则外移细胞器

大多数保持完整，线粒体肿胀，

多受损，溶通透性增加，释放细胞色素

酶体破裂，线粒体肿胀破裂

凋亡坏死第11页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

DNA阶梯状片段化随机断裂磷脂凋亡早期磷脂酰丝氨酸外翻外翻

ATP合成并提供能量耗竭凋亡坏死生物化学：出现180-200bp大小及其倍数的核苷酸片段，DNALADDER第12页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五细胞坏死与凋亡的形态区别第13页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第14页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五细胞凋亡的诱发因素

生理性因素损伤刺激

肿瘤坏死因子家族

病毒感染FasL、TNFP53、PTEN

转化生长因子

细胞毒素细胞癌基因

自由基

神经递质治疗因素

谷氨酸、多巴胺

化疗药物

去除细胞生长因子

紫外线

基质失去粘附特性

中草药

第15页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五细胞凋亡的生理意义1、确保正常发育、生长，根据代谢需要调节细胞数量、保持成体器官正常体积。

如：指（趾）间隙的形成2、维持内环境稳定如：清除受损、突变或衰老的细胞3、防御功能如：使受到病毒感染的细胞凋亡第16页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第二节细胞凋亡的发生机制

一、凋亡相关基因（一）ced基因

线虫（c.elegans），1090个体细胞，其中131个细胞在发育过程中产生凋亡，发现14个基因与凋亡有关；且虫体透明，易于观察。第17页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五细胞内与凋亡有关的基因分2类：

1．存活基因：ced-9：bcl-2蛋白家族

2．致死基因：ced-4：凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1,apoptosisproteaseactivatingfactor-1,

3.致死基因：ced-3：Caspase家族(cycteinylaspartate-specificprotease).天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶线虫人类第18页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五Caspase：1996年Alnemri等统一命名的一类与ICE/Ced-3同源性半胱氨酸蛋白酶。（二）caspase与细胞凋亡第19页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五1.特点：(1)是一种Cys蛋白酶(2)底物Asp-X(3)以酶原形式存在(4)活化的Caspase特异性水解一套底物，导致不可逆的细胞凋亡(5)细胞内有Caspase抑制剂。

IAP,inhibitorsofapoptosisproteins第20页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五2.结构特征①以无活性的形式存在。②在Pro-Caspases的N端均含有一段的前区域（Prodomain）。③活性形式均是由2个大亚基和2个小亚基组成的杂四聚体。一分子Pro-Caspase只能分裂产生1个大亚基和1个小亚基。④大亚基的C端含有活性中心，其中半胱氨酸（C）是必需氨基酸，故属于半胱氨酸蛋白酶类。第21页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五3.分类：14种（1）细胞因子前体：caspase1，4，5，

11，12，13，14

不是凋亡的直接效应分子。

（2）凋亡起始分子：caspase2，8，9，10

（3）凋亡效应分子：caspase

3，6，7

参与介导细胞凋亡。第22页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五ICE家族成员A：3类caspase：蓝色参与炎症反应，红色为执行者，绿色为启动者；B：caspase-3的结构模型；C：caspase-3的活化过程执行者启动者第23页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五4.caspase活化：Caspase酶原有很低的活性若caspase过表达，酶原在高浓度下可自身活化Caspase8，9含有死亡效应域（deatheffectdomain,DED），可相互作用，使酶原自身活化。Caspase8：激活所有酶原,如:Caspase3,6,7,9Caspase9：活化需线粒体释放CytC,活化后激活Caspase2,3,6,8,10。

Caspase3,6,7:效应Caspase。第24页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第25页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五5.Caspase

作用：（1）灭活细胞凋亡抑制蛋白:鼠:Caspase活化的DNA酶:Caspaseactivateddeoxyribonuclease,CAD，细胞凋亡抑制物：inhibitorofCAD,ICADICAD与CAD结合，CAD无活性，Caspase剪切ICAD，ICAD失活，CAD活化，CAD游离，进入细胞核内降解DNA。人：Helacell，DFF（DNAfragmentfactor)

，与ICAD同源第26页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五Ca2+/Mg2+

依赖的核酸内切酶：

多聚·ADP-核糖聚合酶（polyADP-ribosepolymerase,PARP）抑制Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶,与基因完整性的监护有关。

PARP降解，Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶活性增加，裂解核小体间的DNA，导致细胞凋亡。

Caspase第27页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（2）

降解细胞结构蛋白：

降解核纤层蛋白，肌动蛋白，核分裂相关蛋白(3)切割细胞效应蛋白。(4)降解其他的caspases第28页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五6.Caspase活化抑制剂

IAP,inhibitorsofapoptosisproteins

细胞内存在的Caspase抑制蛋白，IAPinhibitorsofapoptosisproteins家族，阻止细胞凋亡过程。第29页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第30页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五二、细胞凋亡的诱导发生

细胞凋亡的信号传递（1）Fas介导细胞凋亡（2）细胞色素C介导的细胞凋亡（3）粒酶GrB诱导细胞凋亡

第31页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五12第32页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第33页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五DR：死亡受体deathreceptors,DR

含DD：死亡结构域，deathdomain,DD

（DD存在于DR之胞内区，和FADD蛋白中）FADD蛋白：Fas相关的死亡结构域，Fas-associateddeathdomain（FADD蛋白含有DD，DED；可与pro-caspase8结合）

DED：死亡效应结构域，deatheffecterdomain,DED（存在于FADD蛋白、一些起始caspase酶原如pro-caspase8中）（1）死亡受体介导的细胞凋亡（外源性的）第34页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

Fas-----细胞表面受体，跨膜蛋白；共4个蛋白第35页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五1.FasLigand（FasL）是Fas的天然配体，两者介导细胞凋亡，FasL主要在淋巴细胞膜上表达。2.FasFas/Apo-1存在于细胞表面的特定区域，一旦被FasL或Fas抗体激活，可将信号传递到细胞内。

Fas属肿瘤坏死因子受体(TNFR)及神经生长因子受体（NGFR）超家族，是细胞凋亡的受体信号，又叫死亡分子。Fas/Apo-1(CD95)第36页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

Fas从人KT3细胞株分离的cDNA克隆。

Apo-1从人SKW6.4细胞株分离的cDNA克隆。后来证明两者完全一致，命名为Fas/Apo-1，或称CD95。

Fas蛋白位于10q33，编码335AA，成熟319AA，是跨膜蛋白。

由胞外区，跨膜区、胞内区组成。胞内区有80AA,称死亡结构域（deathdomain,DD）

第37页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

3.FADD蛋白:

Fas相关死亡结构域蛋白：Fas-associateddeathdomainprotein

包括：DD，死亡结构域

deathdomainDED，死亡效应结构域

deatheffectdomain第38页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五Deathinducingsignalcomples,DISC第39页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

FasL与Fas结合(同三聚体)

Fas的DD成簇，与FADD蛋白结合，

FADD蛋白活化

Caspase8活化

Caspase3，6，7活化

细胞凋亡（1）Fas介导细胞凋亡死亡诱导信号复合物Deathinducingsignalcomplex,DISC第40页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五诱导因素→跨膜电位↓（Δ

Ψm↓）

PTP开放（通透性转换孔）凋亡启动因子（细胞色素C，smac，AIF）释出AIF：凋亡诱导因子（2）线粒体相关的细胞凋亡途径（内源性的）现在，提得最多的、比较公认的线粒体在凋亡中的作用有两点：（1）细胞色素C的释放；（2）Smac/Diablo的释放。第41页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第42页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

（2）细胞色素C介导的细胞凋亡

CytC释放入胞质

与胞浆接头蛋白Apaf-1结合

Apaf-1寡聚化，募集Caspase9原

Caspase9活化

Caspase2,3,6,8,10活化

细胞凋亡

凋亡蛋白酶激活因子1，Apoptoticproteaseactivatingfactor-1Caspaserecuitmentdomain第43页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五5Fas介导细胞凋亡

Caspase8活化第44页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五凋亡诱导因子凋亡蛋白酶激活因子EndoG:endonucleaseG核酸内切酶GAIF：ApoptosisinducingfactorsApaf-1:Apoptoticproteaseactivatingfactor-1第45页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

线粒体仍有足够的CytC，及其他细胞色素，呼吸链完整，产生ATP，保证Caspase活化，细胞凋亡。

CytC释放过多，呼吸链破坏，氧消耗，但是不产生ATP，导致细胞坏死。细胞含有caspase抑制剂，不能导致caspase依赖的细胞凋亡；当线粒体巨通道破坏，CytC释放：第46页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五AKtJNKp53Bcl-2第47页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（3）粒酶的基本结构和功能定义：粒酶，Granzyme，Gr，是CTL和NK细胞杀伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称，以酶原形式存在。分类：GrA,GrB,GrH,GrM,类胰蛋白酶2功能：酶切靶细胞的多种底物蛋白，启动细胞凋亡。

GrB活性最高，与其他粒酶，穿孔素（PEN,Perforin）一起储存在CTL的杀伤颗粒中。第48页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

粒酶进入靶细胞：CTL识别靶细胞，杀伤性颗粒移向靶细胞一极（极化）

GrB,PEN等蛋白释放入细胞间隙

穿孔素(PEN)协助GrB进入靶细胞，定位在胞浆和胞核

第49页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第50页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五CTL肿瘤细胞CTL正在诱导肿瘤细胞凋亡第51页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五GrB诱导细胞凋亡

（1）

Caspase依赖途径：

GrB切割

Caspase10

Caspase3,7,

PARP(多聚ADP核糖聚合酶)，Bid，DNA片段化因子(DFF)

细胞凋亡GrB确保靶细胞即使缺失1种或几种Caspase成员时，仍能走向凋亡。

第52页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五切割

DFF，使CAD游离，降解DNA

结构蛋白Filamin，使细胞骨架破坏

PARP，使Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶活性增加，裂解核小体间的DNA

细胞凋亡GrBDFF：DNA片段化因子CAD：caspase活化DNA酶PARP：多聚ADP-核糖聚合酶人：Helacell，DFF（DNAfragmentfactor)，与ICAD同源第53页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（2）GrB介导线粒体凋亡途径

①GrB切割胞浆Bid，产生活化Bid（tBid）

tBid移至线粒体，募集Bax，

诱导线粒体释放CytC，Smac等因子，细胞凋亡

②诱导线粒体开启膜通透性孔道PTP，破坏线粒体内膜电位，损伤线粒体功能，导致细胞死亡。第54页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第55页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第56页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第三节细胞凋亡的调控细胞自身蛋白的调控作用（一）P53（二）Bcl-2家族蛋白（三）c-myc（四）IAP家族蛋白

第57页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五细胞凋亡的相关调控基因抑制凋亡基因：Bcl-2、IAPs促进凋亡基因:Fas、Bax、P53、双向调控基因:c-myc第58页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五(一)P53野生型的P53蛋白是一种包含393AA的转录因子，活性形式为四聚体，自N端起依次包括转录活化区，DNA结合区，四聚体化区，C端调节区。

1.P53表达细胞中的DNA损伤，纺锤丝断裂，癌基因异常激活，缺氧，ATP储备下降等信号都能导致p53表达增加。已发现有数十种p53的相互作用蛋白，P53在胞浆中的含量受到严密的监控。第59页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五2.P53对细胞周期和凋亡的调节（1）抑制细胞周期p53主要作用于细胞周期的G1/S期，G2/M期等检查点，并引起细胞周期停滞于G1或G2期。p53通过促进p21的表达，抑制如cyclinD-CDK4,cyclinE-CDK2等的活性，引起细胞周期阻滞于G1期。细胞周期负调节因子14-3-3sigma是p53下游靶基因之一，主要通过调节细胞周期的G2/M检查点引起G2期阻滞，且与p21有相互增强作用。第60页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（2）促进细胞凋亡细胞周期在G1，G2/M期的停滞为细胞DNA修复提供了时间，一旦修复失败，p53则在其他因素作用下，有效诱导细胞凋亡。P53促进一系列细胞凋亡的相关分子的表达如Fas，DR5，Bax，Apaf-1，Noxa，PUMA等，增加细胞对凋亡信号的敏感性。P53:molecularpoliceman?第61页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第62页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（二）Bcl-2家族蛋白的调控作用

（1）Bcl-2家族的结构Bcl-2B

celllymphoma/leukemia-2

两个结构域：羧基端的跨膜结构域

Bcl-2同源结构域（Bcl-2homology,BH）Bcl-2—229aa构成，分布在线粒体内膜，细胞内膜表面，内质网，核膜等处Bcl-2和C.elegans中的ced-9有很高的同源性，具有促进细胞存活的功能Bcl-2的功能是延长细胞的寿命，而不是刺激细胞的增殖第63页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五Bcl-2家族分子结构第64页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五(2)BcL-2的同源基因和蛋白质抗凋亡作用，促凋亡作用，有Bax，Bak,BH3onlyprotein:

BcL-2基因家族成员自身或彼此之间有形成二聚体或多聚体的能力，BcL-2家族的蛋白与蛋白相互作用调节着细胞的存活与凋亡。第65页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五Bcl-2,Bax,Bcl-xs对凋亡的作用：

因此，Bcl-2表达增加，并不一定抑制凋亡（1）Bax/Bax形成二聚体，诱导凋亡（2）Bcl-2/Bax二聚体更稳定，Bcl-2增加，

Bcl-2/Bax增加，Bax/Bax减少，抗凋亡。（3）Bcl-xs存在，与Bcl-2形成二聚体，Bcl-2/Bax减少，Bax/Bax增加，诱导凋亡第66页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五(3)Bcl-2抗凋亡机制①直接的抗氧化②抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质③抑制促凋亡的Bax，Bak的作用④抑制Caspases激活⑤维持细胞钙稳态第67页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（三）c-myc

8q24，编码产物p62，在核内，具有转录因子活性，调节基因转录。功能：促进细胞增殖。

c-myc低水平时，细胞生长停滞。

c-myc表达，血清生长因子存在时，促进细胞增殖。

c-myc表达，血清生长因子不存在时，促进细胞凋亡。

几乎所有肿瘤都有c-myc基因的异常表达（高表达）。

第68页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（四）IAP家族蛋白IAP(inhibitorofapoptosisproteins)家族蛋白是细胞凋亡抑制蛋白家族，已发现8个IAP家族成员，NIAP,cIAP-1,cIAP-2，XIAP,survivin,BRUCE,livin,ILP-2第69页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（1）IAP直接抑制Caspase途径的caspase3，7，9的活性。

如在Fas/caspase8途径中，IAP抑制caspase3活性而发挥抑制。在CytC/Apaf-1途径中，XIAP直接与caspase9酶原结合，抑制caspase9活化；又结合caspase3，抑制caspase3作用。

（2）作用于TNFR介导的信号传导通路，抑制细胞凋亡。作用：第70页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第71页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第五节细胞凋亡与疾病

细胞增殖过快及凋亡过少均在肿瘤的发生中起了重要作用P53突变，Bcl-2的高表达在许多肿瘤中都存在第72页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五CarcinogensMutatep53BladderBloodBrainBreastColonEsophagusLiverLungSpleenThyroidCancerTypesChemicalsVirusesRadiationMutatep53Gene第73页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五正常机体细胞生长与死亡的平衡生长坏死、凋亡正常机体细胞凋亡与疾病第74页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五凋亡相对不足肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等第75页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

肿瘤

肿瘤的重要发病机制:

细胞增殖过度

细胞凋亡受抑、死亡不足病变组织内细胞存活>死亡,肿瘤细胞数目的净增长加大可能机制：Bcl-2高表达、IAPs高表达，P53基因突变从发病学上，细胞凋亡实际是机体天然的抗癌机制之一第76页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五细胞凋亡过度神经退行性疾病、造血衰竭性疾病、心肌缺血/再灌注损伤第77页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

心血管疾病心肌缺血、缺血-再灌伤所致心肌细胞死亡：

坏死和凋亡

可能机制：氧化应激、钙超载、p53基因激活

心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少也可能是心力衰竭发生、发展的主要原因之一细胞凋亡过度第78页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第四节细胞凋亡的检测方法

一、形态学检测（一）HE染色（二）透射电镜观察（三）荧光显微镜观察第79页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五透射电镜观察

凋亡早期，染色体核边集，在核膜周围边聚形成新月体形，随之染色体发生固缩，呈电子密度增强，核形不规则。核膜表面凹凸不平，核发生碎裂。细胞体积变小，细胞浆浓缩，其内的细胞器保存较好，或轻度增生。线粒体数目轻度增加和轻度肿胀，细胞浆可见空泡增多，细胞膜保持完整。细胞膜表面微茸毛和伪足减少或消失。凋亡晚期，可见膜包裹内有较完整细胞器和细胞核碎片的凋亡小体。

第80页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五apoptosis概述第81页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五荧光显微镜观察fluorescentmicroscope

Hoechst33258,Hoechst33342,均为DNA特异性染料，与AT键结合，在pH2.0时优先与RNA结合，染色DNA时应调pH7.0。染料不溶于磷酸缓冲液，所以配制时先必须用蒸馏水溶解，4℃避光保存。染料对死细胞或70％冷乙醇处理的细胞可立即染色，对活细胞的染色是渐进的，在10min内可达到饱和。第82页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第83页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

第84页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五二、生化检测

（一）琼脂糖凝胶电泳

（二）原位末端标记技术

第85页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（一）琼脂糖凝胶电泳

原理：染色体从核小体间断裂，为180－200bp或其倍数组成的寡核苷酸片段。通过提取DNA，电泳，UV下，可见DNALadder。观察：凋亡细胞Ladder

坏死细胞Smear

第86页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第87页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五操作：收集细胞，PBS洗涤细胞裂解液

酚抽提氯仿异戊醇抽提

无水乙醇沉淀

TE溶解

电泳观察第88页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五观察：凋亡细胞Ladder

坏死细胞Smear坏死凋亡12345M789Marker10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，1000bp，250bpDNA电泳第89页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第90页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（二）原位末端标记技术

原位末端标记是：将渗入到凋亡细胞的外源性核苷酸（生物素标或荧光标）在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下，与断裂的ssDNA或dsDNA聚合，再通过显色系统显示。通常的方法是：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabeling,称TUNEL）第91页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五常用的标记和显色系统：

生物素标记的dUTP

地高辛标记的dUTP

荧光素标记的dUTP

显色系统：

辣根过氧化物酶标记的抗生物素抗体和DAB,

辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体和DAB,荧光素标记的dUTP(FITC-dUTP)，流式细胞仪或荧光显微镜观察。

第92页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第93页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五该技术不能区分凋亡、坏死、自溶性死亡的细胞，必须结合凋亡细胞的形态学特征加以判断：

凋亡细胞成单个或少数几个孤立地分布在组织中；

具有凋亡细胞的核特征，核固缩，显一个或多个染色体团块，或凋亡小体；

周围或局部无炎症反应。

第94页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五第95页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五三、流式细胞仪检测flowcytometer（一）PI单染

（二）Hoechst33342/PI双染色

（三）Annexinⅴ/PI双染色第96页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五流式细胞仪

flowcytometer

荧光激活细胞分类器fluorescentactivatedcellsorter,FACS

Hoechst33342是双苯并咪唑家族成员，能特异性与DNA螺旋小沟中AT结合。它能被活细胞摄入，也能在摄入后被细胞排出。活细胞对碘化丙锭（PI），溴化乙锭（EB）有拒染性，当细胞被这些染料着染，提示为晚期凋亡或坏死。第97页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（一）PI单染

细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。坏死细胞中，DNA可染性并不立即下降，甚至反而增加，可能是由于细胞坏死时部分DNA变性，引起更多的可染位点。

原理：第98页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五

收集细胞

，PBS洗涤

冷70％乙醇固定12h以上

离心，PBS洗涤，400目筛网过滤

PI（含RNase）染色

流式细胞仪检测

操作：第99页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。

（检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）

AB第100页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五PI单染检测细胞周期改变

细胞周期分析第101页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五（二）Hoechst33342/PI双染色

染料配制：Hoechst33342：配10ug/ml,4℃避光保存。

PI：5ug/ml,4℃避光保存。

第102页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五原理：

凋亡细胞膜在早期是完整的，但细胞膜的通透性已有增加，因此进入早期凋亡细胞的Hoechst比正常细胞多；而EB、PI等不能进入凋亡细胞。即正常细胞不经固定，对EB、PI是拒染的。而坏死细胞早期就被破坏，能被这些染料染色。第103页，共117页，2022年，5月20日，23点19分，星期五操作：悬浮细胞＋Hoechst33342，终浓度1ug/ml,

贴壁细胞消化后，培养液重悬，加Hoechst，

37℃,7-10min，离心，洗涤，