南京农业大学生物化学课件(2)课件

第三节Oxidativephosphorylation一.氧化磷酸化的机理Whatisoxidativephosphorylation氧化磷酸化（oxidativephosphorylation）是指细胞内伴随有机物氧化，利用生物氧化过程中释放的自由能，促使ADP与无机磷酸结合生成ATP的过程。

？一.氧化磷酸化的机理20世纪30年代包括德国生物化学家、诺贝尔奖获得者Meyerhof&Warburg在内的许多生化学家对代谢过程中能量的产生和利用作了深入研究，发现无论在糖酵解或三羧酸循环等代谢过程中，都有伴随着ATP磷酸根的放出或

ADP得到磷酸根的变化这类化学能量高效率的传递方式，指出腺苷三磷酸（ATP）是代谢中能量产生和利用的关键化合物。一.氧化磷酸化的机理1941年FritzLipmann引入“高能磷酸键

(～P)”的概念。1949年美国生化学家EugeneKennedy和AlbertLehninger发现线粒体含有三羧酸循环和呼吸链所需要的全部酶系统，并且发现生物氧化与ADP磷酸化相偶联构成了氧化磷酸化。但是，NADH的氧化和电子传递过程是如何与ADP磷酸化生成ATP反应偶联起来一直不清楚。一.氧化磷酸化的机理关于这一问题目前至少有三种假说比较著名的假说有三个：化学偶联假说构象偶联假说化学渗透学说目前得到公认的是“化学渗透学说”。这个假说是1953年由EdwardSlater最先提出。假说认为在NADH氧化和电子传递过程中产生了一种活泼的高能共价中间物，通过此中间物进一步氧化产生的能量来驱动ATP的合成。这一假说完全是依据底物水平磷酸化机理提出的，例如在糖酵解中，由3-磷酸甘油醛脱氢酶催化的反应就产生了一种活泼且具有高能磷酸基转移势能的酰基磷酸化合物1，3-二磷酸甘油，随后其分子中的高能磷酸基团在磷酸甘油酸激酶的作用下被转移到ADP生成ATP。虽然在糖酵解过程中存在这种例证，但是人们至今未能在线粒体中分离到与之相类似的高能共价中间物。化学偶联假说Chemicalcouplinghypothesis

这个假说是1964年由P.D.Boyer提出。该假说认为作为电子传递体的蛋白质有两种不同的构象：低能构象和高能构象。电子传递的结果使低能构象转变为高能构象，后者再将能量传递给F0-F1-ATP合成酶，使之也发生构象变化，从而推动ADP磷酸化形成ATP。这种假说有一定的实验根据，在电子沿呼吸链流动时，观察到线粒体内膜发生迅速的物理变化，但由于测定构象比较困难，支持这个假说的实验太少。构象偶联假说Conformationalcouplinghypothesis

英国生物化学家PeterDMitchell在1961年提出化学渗透假说，由于该假说提出后逐渐拥有越来越多的实验证据，因而成为目前解释氧化磷酸化偶联机理最为公认的一种假说，并且PeterMitchell因提出该假说而获得了1978年的诺贝尔化学奖。

化学渗透学说

Chemiosmotichypothesis

电子传递体在线粒体内膜上有着不对称分布，传氢体和传电子体交替排列，催化是定向的；Chemiosmotichypothesis—keypoints一.氧化磷酸化的机理复合物I、III、IV将H+从基质内泵向内膜的外侧，而将电子传向其后的电子传递体；化学渗透学说一.氧化磷酸化的机理内膜对质子不具有通透性，这样在内膜两侧形成质子浓度梯度，这就是推动ATP合成的原动力；化学渗透学说一.氧化磷酸化的机理当存在足够高的跨膜质子化学梯度时，强大的质子流通过F1-F0-ATPase进入基质时，释放的自由能推动ATP合成。化学渗透学说一.氧化磷酸化的机理ThereconstitutedvesiclescontainingATPsynthaseandbacteriorhodopsin,alight-drivenprotonpump,reportedbyEfraimRackerandWaltherStoeckeniusin1974化学渗透学说(min)0306090120A492-0,06-0,04-0,020,000,02ATPGramicidinAOADP+PAOH+AOH+ATPi一.氧化磷酸化的机理

F1：球形头部，伸入线粒体基质，由五种亚基组成33,是ATP合酶的催化部分；

F0:

横贯线粒体内膜，含有质子通道，由十多种亚基组成。位于F1与F0之间的柄含有寡霉素敏感性蛋白。F1-F0-ATPase复合物一.氧化磷酸化的机理

由上述化学渗透假说可知，该模型必需具备两个条件：一是线粒体内膜必须是质子不能透过的封闭系统，否则质子梯度将不复存在；二是要求呼吸链和ATP合酶在线粒体内膜中定向地组织在一起，并定向地传递质子、电子和进行氧化磷酸化反应。

重要一.氧化磷酸化的机理

目前这两方面都获得了一些实验证据，例如能携带质子穿过线粒体内膜的物质（如2,4-二硝基苯酚）可破坏线粒体内膜对质子的透性壁垒，使质子电化学梯度消失。

另外根据测算，膜间隙的pH较内膜低1.4个单位，并且线粒体内膜两侧原有的外正内负跨膜电位升高。重要一.氧化磷酸化的机理F1-F0-ATPase复合物P/O(磷氧比)：在生物氧化过程中，伴随ADP磷酸化所消耗的无机磷酸的磷原子数与消耗的分子氧的氧原子数之比。即每消耗1个氧原子所产生的ATP的分子数。

二.氧化磷酸化的P/O比测定结果表明：NADH经呼吸链完全氧化时，P/O为3，即1分子的NADH通过呼吸链将电子最终传递给O2可产生3个ATP；二.氧化磷酸化的P/O比二.氧化磷酸化的P/O比FADH2经呼吸链完全氧化时，P/O为2，即1分子的FADH2通过呼吸链将电子最终传递给O2可产生2个ATP。为什么？二.氧化磷酸化的P/O比为什么？二.氧化磷酸化的P/O比

但是,近年来很多实验结果都证明，以NADH作为电子供体时，测得的P/O比值大于2。以琥珀酸作为电子供体时，侧得的P/O比值大于1；所以P/O比值不一定是整数。例如，-羟丁酸经过NADH途径的P/O比值为2.4~2.6，产生的ATP数目为2.5；而琥珀酸经过FADH2的P/O比值为1.7，产生的ATP数目为1.5。

二.氧化磷酸化的P/O比因此，虽然电子转移伴随着ATP的合成，但不能仅以P/O比值作为ATP生成数的依据，而应考虑一对电子从NADH或FADH2传递到氧的过程中，有多少质子从线粒体基质泵出，以及有多少质子必须通过ATP合酶返回基质以用于ATP的合成，这样才能从本质上确定ATP的生成数量。

二.氧化磷酸化的P/O比

目前被广泛接受的观点是：ATP、ADP和无机磷酸通过线粒体内膜的转运是由ATP-ADP载体和磷酸转位酶催化的。已知每合成1个ATP需要3个质子通过ATP合酶。与此同时，把一个ATP分子从线粒体基质转运到胞液需要消耗1个质子，所以每形成1个分子的ATP就需要4个质子的流动。因此，如果一对电子通过NADH电子传递链可泵出10个质子，则可形成2.5个分子ATP；如果一对电子通过FADH2电子传递链有6个质子泵出，则可形成1.5个ATP分子。三.ATP酶-构象偶联假说

该假说是1964年由美国生物化学家PaulBoyer最先提出，他认为电子传递过程中，线粒体内膜上的蛋白质组分发生了构象变化，转变成一种高能形态。这种高能形态通过将能量转移到ADP合成ATP后，又得以恢复其原来的构象。随着人们对ATP合酶结构的研究和认识不断深入，在构象偶联假说的基础上形成了ATP合酶结合变化和旋转催化假说。三.ATP酶-构象偶联假说

ATP合酶结合变化和旋转催化假说认为，ATP合酶与底物核苷酸的作用是按照结合变化机理进行的。构成ATP合酶头部的α3β3亚基构成3个催化部位，中部的γε亚基在质子推动力的驱动下相对于α3β3作旋转运动。由于3个β亚基与γε亚基的不对称接触，使其分别处于三种不同的状态，即无核苷酸结合的空置状态（O）、结合ADP+Pi的松散结合状态（L）和结合ATP的紧密结合状态（T）。Rotationofgleadstosequentialbindingchangesforeachbsubunit.三.ATP酶-构象偶联假说

当质子推动力驱使H+经F0质子通道进入时，F0组分质子化而发生构象改变，积累足够的扭矩力，推动γε相对α3β3旋转120°，使处于T态的催化部位释放ATP变成O态，同时L态催化部位上生成ATP变为T态，O态结合ADP+Pi变为L态gggBoyerThebinding-changemodelwaselegantlysupportedbytwootherexperimentalobservationsX-raycrystallographyrevealedthatthethreebsubunitsofF1assumesthreedifferentconformations,withboundADP,ATPanalog,oremptyrespectively.Rotationsofthegsubunitandthec-ringoftheF1unitinthreediscretestepsof120o(asbeingpoweredbyATPhydrolysiscatalyzedbythebsubunits)havebeendirectlyobservedusingfluorescencemicroscopy(1997)Rod-shapedgsubunit.ADPApp(NH)pEmptyStructuredeterminationindicatesthatindeedthethreebsubunitsareinequivalentinconformation!(JohnWalker,1994)T(tight)L(loose)O(open)Rotationoftheg

subunitandtheringofcsubunitsintheFoF1complexwasobservedbyinvitrostudiesusingfluorescencemicroscopy(K.Kinosita,1997)a3b3g,withthegsubunitlinkedtoanactinfilamentwillalsorotatewhenATPisadded.FluorescencetlylabeledTheworld’ssmallestmolecularmotor:rotationalcatalysis.Modelontherotationofthec-ringinATPsynthase:twohalf-channelsforH+ontheasubunithasbeenproposed.(3ATPmadeper10-14protonstransported:~3H+/ATP.)Asp

1.解偶联剂

解偶联剂（uncoupler）是指那些不阻断呼吸链的电子传递，但能抑制ADP通过磷酸化作用转化为ATP的化合物。它们也被称为氧化磷酸化解偶联剂。

最早发现的一个解偶联剂是2,4-二硝基苯酚（2,4-dinitrophenol,DNP），它是一种弱酸性亲脂化合物，在pH7条件下，DNP以解离形式存在，不能通过线粒体内膜。但是在酸性环境中，DNP转变为脂溶性的非解离形式，可携带质子透过线粒体内膜。这样就破坏了电子传递形成的跨膜质子电化学梯度四、氧化磷酸化的抑制1.解偶联剂

在解偶联剂存在时，电子沿呼吸链的传递能正常进行，但不能偶联产生ATP，这样就使电子传递所产生的自由能以热能的形式被消耗。由于DNP解偶联剂只专一性地抑制与呼吸链相偶联的ATP的形成过程，因此，它不会影响底物水平的磷酸化。四、氧化磷酸化的抑制

这类化合物直接作用于ATP合酶复合体，从而抑制ATP的合成。它们使膜外质子不能通过ATP合酶复合体返回膜内，使膜内质子继续泵出到膜外显然越来越困难，最后不得不停止，所以这类抑制剂间接抑制了电子传递和分子氧的消耗。

寡霉素属于此类抑制剂，它与F0的一个亚基结合而抑制F1。2.氧化磷酸化抑制剂四、氧化磷酸化的抑制3.离子载体抑制剂

离子载体抑制剂（ionophore）是指那些能与某种离子结合，并作为这些离子的载体携带离子穿过线粒体内膜的脂双层进入线粒体的化合物。这类抑制剂均是脂溶性物质，它们与解偶联剂的区别在于它们能结合除H+以外的其它一价阳离子，例如缬氨霉素（Valinomycin）可结合K+，短杆菌肽可结合K+、Na+和其它一价阳离子穿过线粒体内膜。因此离子载体抑制剂增大了线粒体内膜对一价阳离子的通透性，从而破坏了膜两侧的电位梯度，最终导致氧化磷酸化过程被抑制。四、氧化磷酸化的抑制五.电子传递抑制剂

凡是能够阻断电子传递链中某部位电子传递的物质称为电子传递抑制剂，由于阻断部位物质的氧化还原状态能被测定，所以利用电子传递抑制剂是研究电子传递顺序的重要方法，下面列举了若干种常见的重要的电子传递抑制剂。1、鱼藤酮等阻断从NADH向CoQ的传递鱼藤酮（rotenone）、安密妥（amytal）、杀粉蝶菌素（piericidine）等。它们的作用是抑制复合物I，阻断电子由NADH向CoQ的传递，但不影响FADH2到CoQ的氢传递。鱼藤酮是一种极毒的植物毒素，常用作杀虫剂。五.电子传递抑制剂2、抗霉素A

阻断复合物III的电子传递抗霉素A（antimycinA），它是从灰色链球菌分离出的一种抗生素，抑制复合物Ⅲ的电子传递，即阻断细胞色素还原酶中电子的传递，从而抑制了电子从还原型的CoQ（QH2）到细胞色素c1的传递。五.电子传递抑制剂3、氰化物、叠氮化物、CO、H2S

阻断复合物IV向O